蛋白质提取与蛋白酶解：一种从前列腺肿瘤组织样本中获取蛋白质并将其酶解为肽段的方法

摘要

来源：Cheng, L. C. 等. 利用磷酸肽富集结合非标记定量质谱法研究前列腺癌中的磷酸化蛋白质组. J. Vis. Exp. (2018)

本视频介绍了从前列腺肿瘤组织中提取蛋白质并进行消化以获得肽段的技术。这些肽段经过进一步分析，有助于发现肿瘤治疗的新靶点。

方案

1. 蛋白质提取

1. 配制裂解缓冲液（表1）。（体积取决于待收获样本的数量。）
2. 组织收获
   1. 称取肿瘤组织，按每100 mg组织加入2 mL预冷的裂解缓冲液，置于培养试管中。（通常需要50至150 mg的组织湿重。）
3. 使用手持式或台式匀浆器对裂解液进行匀浆处理（脉冲处理2次，每次15秒）。在处理第一个样本前以及样本之间，依次使用10%次氯酸钠、70%乙醇和去离子水清洗匀浆器。
4. 为进行还原和烷基化，将匀浆后的样品在95 °C加热5分钟，随后在冰上冷却15分钟。在冰上对裂解液进行超声处理3次（即每次脉冲30秒，脉冲间间隔60秒）。此时样品不应呈现黏稠或结块状态。再次将裂解液在95 °C加热5分钟。
5. 将裂解液连同超声处理所用的试管一起，使用摆桶转子在15 °C、3,500 × g 条件下离心15分钟。收集上清液，弃去沉淀物。
6. 通过Bradford法测定蛋白浓度。如有必要，用裂解缓冲液将裂解液稀释至5 mg/mL。于-20 °C保存。
   注意：实验可在此处暂停。将样品在-80 °C冷冻保存，用于后续分析。

2. 裂解液消化

1. 使用 100 mM Tris（pH = 8.5）将样品稀释 12 倍，以减少胍盐酸盐的含量。将所有样品稀释至相同体积，以尽量减少因消化不均带来的影响。保留 12.5 µg 未消化的裂解液，用于在考马斯亮蓝染色凝胶上进行验证。
2. 对于 5 mg 蛋白质，加入 10 µg 赖氨酰内肽酶（Lys-C），在室温下孵育 5–6 小时。通过加入 1 M 未滴定 Tris（pH ~11）将 pH 调整至 8.0。
3. 在 1 mM HCl（含 20 mM CaCl₂）中配制 1 mg/mL 的经 TPCK（L-1-对甲苯磺酰胺-2-苯乙基氯甲基酮）处理的胰蛋白酶。按胰蛋白酶与蛋白质 1:100 的比例加入胰蛋白酶，在 37 °C 下孵育 3 小时。
4. 加入与步骤 2.3 中等量的新鲜胰蛋白酶，在 37 °C 下过夜孵育。
5. 保留 12.5 µg 已消化的裂解液，用于在考马斯亮蓝染色凝胶上确认消化是否完全。

3. 反相萃取

1. 记录裂解液体积。使用15 mL、截留分子量为10 kDa的滤器过滤样品。将样品在3,500 x g 使用摆桶转子（或 3,500 x g 在15 °C下以固定角转子离心，直至截留体积小于250 µL（约需45–60分钟）。收集穿流液，弃去截留物。

表1：缓冲液与溶液。 本表列出了本实验方案中所用缓冲液和溶液的组成成分。

缓冲液	体积	成分
6 M 盐酸胍裂解缓冲液	50 mL	6 M 盐酸胍，100 mM Tris（pH 8.5），10 mM 三(2-羧乙基)膦，40 mM 氯乙酰胺，2 mM 原钒酸钠，2.5 mM 焦磷酸钠，1 mM β-甘油磷酸钠，500 mg 正辛基糖苷，加超纯水至终体积
100 mM 焦磷酸钠	50 mL	2.23 g 十水焦磷酸钠，加超纯水至终体积
1 M β-甘油磷酸钠	50 mL	15.31 g β-甘油磷酸钠，加超纯水至终体积
5% 三氟乙酸	20 mL	将 1 mL 100% 三氟乙酸加入 19 mL 超纯水中
0.1% 三氟乙酸	250 mL	将 5 mL 5% 三氟乙酸加入 245 mL 超纯水中
pY 洗脱缓冲液	250 mL	0.1% 三氟乙酸，40% 乙腈，加超纯水至终体积
pST 洗脱缓冲液	250 mL	0.1% 三氟乙酸，50% 乙腈，加超纯水至终体积
免疫沉淀结合缓冲液	200 mL	50 mM Tris（pH 7.4），50 mM 氯化钠，加超纯水至终体积
25 mM 碳酸氢铵，pH 7.5	10 mL	将 19.7 mg 溶解于 10 mL 无菌超纯水中，用 1 N 盐酸调节 pH 至 7.5（约 10–15 µL/10 mL 溶液），现配现用
1 M 磷酸盐缓冲液，pH 7	1,000 mL	423 mL 1 M 磷酸二氢钠，577 mL 1 M 磷酸氢二钠
平衡缓冲液	14 mL	6.3 mL 乙腈，280 µL 5% 三氟乙酸，1740 µL 乳酸，5.68 mL 超纯水
洗涤缓冲液	20 mL	9 mL 乙腈，400 µL 5% 三氟乙酸，10.6 mL 超纯水
质谱溶液	10 mL	500 µL 乙腈，200 µL 5% 三氟乙酸，9.3 mL 超纯水
缓冲液 A	250 mL	5 mM 磷酸二氢钾（pH 2.65），30% 乙腈，5 mM 氯化钾，加超纯水至终体积
缓冲液 B	250 mL	5 mM 磷酸二氢钾（pH 2.65），30% 乙腈，350 mM 氯化钾，加超纯水至终体积
0.9% 氢氧化铵	10 mL	300 μL 29.42% 氢氧化铵，9.7 mL 超纯水

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
超低温冰箱	Panasonic	MDF-U76V
–20 °C 冰箱°C	VWR	scpmf-2020
摆动转子吊桶	ThermoFisher Scientific	75004377
滚轴混合器	ThermoFisher Scientific	415110Q
低蛋白吸附 Eppendorf 管	Eppendorf	22431081
胰蛋白酶，TPCK 处理	Worthington Biochemicals	LS003740
赖氨酰内肽酶	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	125-05061
MilliQ 水			用于配制所有溶液和缓冲液的去离子水
超声破碎仪	Fisher Scientific	FB-120	超声波处理器
Polytron PT 匀浆系统	Kinematica AG	PT 10-35 GT	匀浆器