多肽纯化：一种基于反相高效液相色谱法从消化后的蛋白质裂解液中提取多肽的技术

摘要

来源：Cheng, L. C. 等. 利用磷酸肽富集结合非标记定量质谱法研究前列腺癌中的磷酸化蛋白质组. J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中，我们展示了采用反相高效液相色谱法从消化后的蛋白质裂解液混合物中纯化肽段。这些纯化的肽段随后被冻干并储存，用于下游应用。对肽段的分析有助于理解细胞信号传导及癌症相关的分子机制。

方案

1. 反向相萃取

1. 在玻璃小瓶中加入预先消化的蛋白质裂解液。使用15 mL、截留分子量为10 kDa的滤膜过滤样品。在15 °C下，使用摆桶转子以3,500 × g离心（或使用固定角转子在3,500 × g条件下离心），直至截留液体积小于250 µL（约需45–60分钟）。收集滤过液，弃去截留物。
   注意：实验可在此处暂停。将样品在-80 °C下冷冻保存以备后续使用。
2. 为酸化样品，每毫升裂解液中加入约20 µL的5%三氟乙酸（TFA）。充分混匀后，使用pH试纸测定样品pH值，并用5% TFA调节pH至2.5。
3. 将C-18柱的较短端连接至真空 manifold。将真空压力调节至17–34 kPa（或根据制造商说明进行设置）。使用 玻璃 移液管，以3 mL的100%乙腈（ACN）润洗柱子。切勿让柱子干燥。
4. 使用 玻璃 移液管，以0.1% TFA溶液分两次、每次3 mL（共6 mL）平衡柱子。将酸化后的样品加载至柱子中。每次加入量不得超过3 mL。调节真空度，使流速控制在每秒约1–2滴。
5. 使用 玻璃 移液管，以0.1% TFA溶液分三次、每次3 mL（共9 mL）洗涤柱子。用2 mL的40% ACN、0.1% TFA溶液洗脱柱子。将洗脱液收集至两个 玻璃 培养管中，每管2 mL。弃去柱子。
6. 用Parafilm封住洗脱液管口，并用20G针头在封膜上刺3–5个小孔。将洗脱液在干冰上冷冻至少30分钟，直至完全凝固。
7. 将样品冷冻干燥过夜。次日，在关闭冻干机前确认样品已完全干燥。将培养管置于50 mL锥形管中，用柔软擦拭纸包裹后，于-80 °C保存。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
超低温冰箱	Panasonic	MDF-U76V
–20 °C 冰箱	VWR	scpmf-2020
摆动转子吊桶	ThermoFisher Scientific	75004377
真空 manifold	Restek	26080
冷冻干燥机	Labconco	7420020
CentriVap 台式真空浓缩仪	Labconco	7810010
Amicon Ultra-15 离心过滤装置	Millipore Sigma	UFC901024
滚轴混合仪	ThermoFisher Scientific	415110Q
玻璃培养管	Fisher Scientific	14-961-26
Parafilm 封口膜	Fisher Scientific	13-374-12
20G 针头	BD	B305175
Kimwipes 擦镜纸	Fisher Scientific	06-666A
螺口冻存管	ThermoFisher Scientific	379189
Nunc 15 mL 圆锥形离心管	ThermoFisher Scientific	12-565-268
低蛋白吸附 Eppendorf 管	Eppendorf	22431081
3 mL 注射器	BD	309657
三氟乙酸（TFA）	Fisher Scientific	PI-28904
乙腈（ACN）	Fisher Scientific	A21-1
MilliQ 水			用于配制所有溶液和缓冲液的去离子水