磷酸化肽富集：一种基于抗体的免疫沉淀技术，用于从复杂的肽混合物中分离特异性的磷酸化肽

本文内容

摘要

在本视频中，我们演示了从肽段混合物中使用抗体进行磷酸化肽段的免疫沉淀。富集后的磷酸化肽段经真空浓缩并保存，用于后续分析。

方案

1. pY 肽段的免疫沉淀与富集

将纯化后的肽段冻干粉各组分分别用0.5 mL预冷的免疫沉淀（IP）结合缓冲液重悬。将第二组分的0.5 mL重悬液转移至第一组分中以合并组分，并保留移液器吸头。剧烈涡旋振荡（避免反复吹打）以确保样品完全溶解，随后转移至3.6 mL螺口冻存管中。
用另外0.5 mL IP结合缓冲液冲洗冻干管表1)。使用同一枪头将溶液转移至3.6 mL螺口管中，以尽量减少样品损失。再重复洗涤1次，最终重悬体积为2 mL（对应5 mg蛋白）。测定样品pH值，确保其约为7.4。若pH过低，逐次加入10 µL 1 M Tris（未滴定，pH ~11）进行调节；若pH过高，逐次加入10 µL稀释盐酸（1:25 或 1:100）进行调节。
预洗 pY 珠子（用于 5 mg 起始裂解液）
1. 每个样本需要 25 µg 的 4G10 抗体和 12.5 µg 的 27B10.4 抗体。使用切去尖端的 p200 移液枪将抗体分别转移至微量离心管中后，用 450 µL 冰冷的 IP 结合缓冲液洗涤抗体 2 次。在 4 °C 下以 100 × g 离心 1 分钟，并吸除上清液。
2. 将磁珠用IP结合缓冲液重悬至储存浓度0.5 mg/mL。（切勿涡旋振荡磁珠。）将所需体积的浆液（每份样品分别加入50 µL 4G10抗体浆液和25 µL 27B10.4抗体浆液）分装....

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材料

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