来源：Cheng, L. C. 等。利用非标记定量质谱结合磷酸肽富集技术研究前列腺癌中的磷酸化蛋白质组。J. Vis. Exp. (2018)。
在本视频中，我们演示了从肽段混合物中使用抗体进行磷酸化肽段的免疫沉淀。富集后的磷酸化肽段经真空浓缩并保存，用于后续分析。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
磷酸化肽富集：一种基于抗体的免疫沉淀技术，用于从复杂的肽混合物中分离特异性的磷酸化肽
3K 次观看
⸱
2023年4月30日
本文内容
摘要
方案
1. pY 肽段的免疫沉淀与富集
- 将纯化后的肽段冻干粉各组分分别用0.5 mL预冷的免疫沉淀（IP）结合缓冲液重悬。将第二组分的0.5 mL重悬液转移至第一组分中以合并组分，并保留移液器吸头。剧烈涡旋振荡（避免反复吹打）以确保样品完全溶解，随后转移至3.6 mL螺口冻存管中。
- 用另外0.5 mL IP结合缓冲液冲洗冻干管表1)。使用同一枪头将溶液转移至3.6 mL螺口管中，以尽量减少样品损失。再重复洗涤1次，最终重悬体积为2 mL（对应5 mg蛋白）。测定样品pH值，确保其约为7.4。若pH过低，逐次加入10 µL 1 M Tris（未滴定，pH ~11）进行调节；若pH过高，逐次加入10 µL稀释盐酸（1:25 或 1:100）进行调节。
- 预洗 pY 珠子（用于 5 mg 起始裂解液）
- 每个样本需要 25 µg 的 4G10 抗体和 12.5 µg 的 27B10.4 抗体。使用切去尖端的 p200 移液枪将抗体分别转移至微量离心管中后，用 450 µL 冰冷的 IP 结合缓冲液洗涤抗体 2 次。在 4 °C 下以 100 × g 离心 1 分钟，并吸除上清液。
- 将磁珠用IP结合缓冲液重悬至储存浓度0.5 mg/mL。（切勿涡旋振荡磁珠。）将所需体积的浆液（每份样品分别加入50 µL 4G10抗体浆液和25 µL 27B10.4抗体浆液）分装至同一管中后，于4 °C下以200 × g离心1分钟。在将磁珠返回冰箱储存前，用上清液冲洗管壁。
- 将预洗的pY磁珠加入螺口冷冻管中的重悬样品溶液中，4 °C下于翻转摇床中孵育过夜。
- 将螺口盖冻存管放入经无尘擦拭纸衬垫的50 mL离心管中。以100 × g离心1分钟，沉淀磁珠。保留上清液，用于富集pST肽段。
- 用 300 µL IP 结合缓冲液重悬珠子。转移至 2 mL 微离心管中，在 4 °C 下以 100 × g 离心 1 分钟。
- 用 200 µL IP 结合缓冲液冲洗孵育管 3 次，每次将液体转移至同一微量离心管中，然后离心沉淀。
- 用 500 µL IP 结合缓冲液在微量离心管中洗涤磁珠 3 次，每次在 100 × g 下离心 1 分钟。随后，用 450 µL 25 mM NH₄HCO₃ 溶液洗涤磁珠 4 次4HCO3，pH 7.5，以100 × g离心1分钟。使用新鲜的25 mM NH4HCO3 每次从粉末配制溶液。
- 以 1,500 x g 离心 1 分钟。使用加样枪头，将枪头尖端略低于珠子表面，彻底吸除上清液。
- 向珠子中加入4倍体积的0.1%三氟乙酸（TFA）即加入300 µL 0.1% TFA（适用于75 µg pY磁珠悬液），充分混匀，于37 °C在恒温混匀仪中以1,000 rpm孵育15分钟。
- 将重悬液转移至0.2 µm离心滤管中。快速离心收集洗脱液管中的液体，并用P10移液器将残余体积转移至同一离心滤管。在850 × g下离心滤管1分钟。将滤出液转移至低蛋白吸附的微量离心管中。在40 °C下真空浓缩过夜，加热时间为300分钟，至完全干燥。
注意： 此处可暂停实验。将样品在 -80 °C 冷冻，待日后继续操作。
表1：缓冲液与溶液。 本表列出了本实验方案中所用缓冲液和溶液的组成成分。
| 缓冲液 | 体积 | 成分 |
| 6 M 盐酸胍裂解缓冲液 | 50 mL | 6 M 盐酸胍，100 mM Tris（pH 8.5），10 mM 三(2-羧乙基)膦，40 mM 氯乙酰胺，2 mM 正钒酸钠，2.5 mM 焦磷酸钠，1 mM β-甘油磷酸钠，500 mg 正辛基糖苷，加超纯水至终体积 |
| 100 mM 焦磷酸钠 | 50 mL | 2.23 g 十水焦磷酸钠，加超纯水至终体积 |
| 1 M β-甘油磷酸钠 | 50 mL | 15.31 g β-甘油磷酸钠，加超纯水至终体积 |
| 5% 三氟乙酸 | 20 mL | 将 1 mL 100% 三氟乙酸加入 19 mL 超纯水中 |
| 0.1% 三氟乙酸 | 250 mL | 将 5 mL 5% 三氟乙酸加入 245 mL 超纯水中 |
| pY 洗脱缓冲液 | 250 mL | 0.1% 三氟乙酸，40% 乙腈，加超纯水至终体积 |
| pST 洗脱缓冲液 | 250 mL | 0.1% 三氟乙酸，50% 乙腈，加超纯水至终体积 |
| 免疫沉淀结合缓冲液 | 200 mL | 50 mM Tris（pH 7.4），50 mM 氯化钠，加超纯水至终体积 |
| 25 mM 碳酸氢铵，pH 7.5 | 10 mL | 将 19.7 mg 溶解于 10 mL 无菌超纯水中，用 1 N 盐酸调节 pH 至 7.5（约 10–15 µL/10 mL 溶液），现配现用 |
| 1 M 磷酸盐缓冲液，pH 7 | 1,000 mL | 423 mL 1 M 磷酸二氢钠，577 mL 1 M 磷酸氢二钠 |
| 平衡缓冲液 | 14 mL | 6.3 mL 乙腈，280 µL 5% 三氟乙酸，1740 µL 乳酸，5.68 mL 超纯水 |
| 洗涤缓冲液 | 20 mL | 9 mL 乙腈，400 µL 5% 三氟乙酸，10.6 mL 超纯水 |
| 质谱溶液 | 10 mL | 500 µL 乙腈，200 µL 5% 三氟乙酸，9.3 mL 超纯水 |
| 缓冲液 A | 250 mL | 5 mM 磷酸二氢钾（pH 2.65），30% 乙腈，5 mM 氯化钾，加超纯水至终体积 |
| 缓冲液 B | 250 mL | 5 mM 磷酸二氢钾（pH 2.65），30% 乙腈，350 mM 氯化钾，加超纯水至终体积 |
| 0.9% 氢氧化铵 | 10 mL | 300 μL 29.42% 氢氧化铵，9.7 mL 超纯水 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 冷冻干燥机 | Labconco | 7420020 | |
| CentriVap 台式真空浓缩仪 | Labconco | 7810010 | |
| Kimwipes 擦拭纸 | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Millipore 0.2 µm 离心过滤器 | Millipore Sigma | UFC30GVNB | |
| 低蛋白吸附 Eppendorf 离心管 | Eppendorf | 22431081 | |
| 抗磷酸化酪氨酸抗体-琼脂糖偶联物，克隆号：4G10 | Millipore Sigma | 16101 | |
| 27B10.4 抗体 | Cytoskeleton | APY03-beads | |
| 肽定量检测试剂盒 | Thermo Scientific | 23275 | |
| TopTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 | |
| SCX 柱（PolySULFOETHYL A） | PolyLC Inc | SPESE1203 | |
| 3 mL 注射器 | BD | 309657 | |
| MilliQ 水 | 用于配制所有溶液和缓冲液的去离子水 | ||
| 三氟乙酸（TFA） | Fisher Scientific | PI-28904 | |
| 乙腈（ACN） | Fisher Scientific | A21-1 | |
| 氯化钾 | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| 乳酸 | Sigma-Aldrich | 69785-250ML | |
| 氢氧化铵 | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Tris 碱 | Fisher Scientific | BP152-5 |
标签
