来源：Cheng, L. C. 等. 利用无标记定量质谱结合磷酸化肽富集技术研究前列腺癌中的磷酸化蛋白质组。J. Vis. Exp. (2018)
本视频展示了基于二氧化钛的磷酸化肽段富集方法，这些磷酸化肽段提取自前列腺肿瘤组织。经富集后的磷酸化肽段可用于后续应用，例如蛋白质表征，以研究参与前列腺癌进展的细胞信号通路。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
基于二氧化钛的磷酸化肽段富集：一种从肽库中选择性分离磷酸化肽段的方法
3.1K 次观看
⸱
2023年4月30日
本文内容
摘要
方案
1. 二氧化钛富集磷酸化酪氨酸肽段
- 将干燥的磷酸化肽重悬于 200 µL 的 50% ACN、0.1% TFA 溶液中。涡旋混匀，并在 10,000 × g 离心 30 秒。重复一次，以充分重悬。
- 准备装有二氧化钛（TiO2）微珠的移液枪头，该枪头适用于 200 µL 样品。
- 轻轻敲击枪头较小的一端，使内部材料移至该端。加入 200 µL 100% ACN 洗涤枪头，随后将枪头倒置，轻弹小端，使液体流向盖端。
- 使用剃刀切去枪头的小端，并将其置于低蛋白吸附管上方。（避免使用聚苯乙烯管，因为 TiO2 会粘附在管壁上。）取下管盖，插入微量移液器将残留的 ACN 推出。再用 200 µL 100% ACN 洗涤一次。此时 TiO2 微珠已转移至低蛋白吸附管中，用于后续步骤。
- 用 500 µL 100% ACN 对 TiO2 进行预处理，重复两次。用移液器吹打使微珠与溶剂充分混合。在 100 × g 离心 1 分钟。
- 用 500 µL 0.2 M 磷酸钠缓冲液（pH ~7）对 TiO2 进行活化处理，重复两次。再用 300 µL 平衡缓冲液洗涤三次。由于 TiO2 密度较高，微珠会迅速沉降。
- 向低蛋白吸附管中加入 400 µL 50% ACN、0.1% TFA 溶液，随后加入 84 µL 乳酸。将重悬的磷酸化肽转移至该管中，并在室温下使用翻转混匀仪孵育 1 小时。
- 在 100 × g 离心 1 分钟使微珠沉淀。用 300 µL 平衡缓冲液（表 1）洗涤两次，每次均在 100 × g 离心 1 分钟。
- 用 300 µL 漂洗缓冲液漂洗微珠两次。将微珠转移至 0.2 µm 离心过滤装置中，在 1,500 × g 离心 1 分钟。
- 将滤膜装置转移至一支洁净的 1.5 mL 低蛋白吸附管中。用 200 µL 水中含 0.9% NH₃ 的溶液洗脱两次。使用 pH 试纸检测洗脱液 pH，应介于 10 至 11 之间。将洗脱液真空浓缩过夜，以完全蒸发氨。
表1：缓冲液与溶液。 本表列出了本实验方案中所用缓冲液和溶液的组成成分。
| 缓冲液 | 体积 | 成分 |
| 6 M 盐酸胍裂解缓冲液 | 50 mL | 6 M 盐酸胍，100 mM Tris（pH 8.5），10 mM 三(2-羧乙基)膦，40 mM 氯乙酰胺，2 mM 正钒酸钠，2.5 mM 焦磷酸钠，1 mM β-甘油磷酸钠，500 mg 正辛基-糖苷，加超纯水至终体积 |
| 100 mM 焦磷酸钠 | 50 mL | 2.23 g 十水焦磷酸钠，加超纯水至终体积 |
| 1 M β-甘油磷酸钠 | 50 mL | 15.31 g β-甘油磷酸钠，加超纯水至终体积 |
| 5% 三氟乙酸 | 20 mL | 将 1 mL 100% 三氟乙酸加入 19 mL 超纯水中 |
| 0.1% 三氟乙酸 | 250 mL | 将 5 mL 5% 三氟乙酸加入 245 mL 超纯水中 |
| pY 洗脱缓冲液 | 250 mL | 0.1% 三氟乙酸，40% 乙腈，加超纯水至终体积 |
| pST 洗脱缓冲液 | 250 mL | 0.1% 三氟乙酸，50% 乙腈，加超纯水至终体积 |
| 免疫沉淀结合缓冲液 | 200 mL | 50 mM Tris（pH 7.4），50 mM 氯化钠，加超纯水至终体积 |
| 25 mM 碳酸氢铵，pH 7.5 | 10 mL | 将 19.7 mg 溶解于 10 mL 无菌超纯水中，用 1 N 盐酸调节 pH 至 7.5（约 10–15 µL/10 mL 溶液），现配现用 |
| 1 M 磷酸盐缓冲液，pH 7 | 1,000 mL | 423 mL 1 M 磷酸二氢钠，577 mL 1 M 磷酸氢二钠 |
| 平衡缓冲液 | 14 mL | 6.3 mL 乙腈，280 µL 5% 三氟乙酸，1740 µL 乳酸，5.68 mL 超纯水 |
| 洗涤缓冲液 | 20 mL | 9 mL 乙腈，400 µL 5% 三氟乙酸，10.6 mL 超纯水 |
| 质谱溶液 | 10 mL | 500 µL 乙腈，200 µL 5% 三氟乙酸，9.3 mL 超纯水 |
| 缓冲液 A | 250 mL | 5 mM 磷酸二氢钾（pH 2.65），30% 乙腈，5 mM 氯化钾，加超纯水至终体积 |
| 缓冲液 B | 250 mL | 5 mM 磷酸二氢钾（pH 2.65），30% 乙腈，350 mM 氯化钾，加超纯水至终体积 |
| 0.9% 氢氧化铵 | 10 mL | 300 μL 29.42% 氢氧化铵，9.7 mL 超纯水 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 真空多联装置 | Restek | 26080 | |
| 冷冻干燥机 | Labconco | 7420020 | |
| CentriVap 台式真空浓缩仪 | Labconco | 7810010 | |
| 滚轴混合仪 | ThermoFisher Scientific | 415110Q | |
| 剃刀刀片 | Fisher Scientific | 620177 | |
| Amicon Ultra-15 离心过滤单元 | Millipore Sigma | UFC901024 | |
| Nunc 15 mL 锥形管 | ThermoFisher Scientific | 12-565-268 | |
| Millipore 0.2 µm 离心滤膜 | Millipore Sigma | UFC30GVNB | |
| 低蛋白吸附 Eppendorf 管 | Eppendorf | 22431081 | |
| 抗磷酸化酪氨酸抗体，琼脂糖偶联，克隆号：4G10 | Millipore Sigma | 16101 | |
| 多肽定量检测试剂盒 | Thermo Scientific | 23275 | |
| 三氟乙酸（TFA） | Fisher Scientific | PI-28904 | |
| 乙腈（ACN） | Fisher Scientific | A21-1 | |
| 乳酸 | Sigma-Aldrich | 69785-250ML | |
| 氢氧化铵 | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| 磷酸二氢钾 | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| 氯化钾 | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| 二水合氯化钙 | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Tris 碱 | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| MonoTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 |
