基于二氧化钛的磷酸肽富集:一种从 Peptide Library 中选择性分离磷酸肽的方法

1. pY 肽的二氧化钛富集

将
1. 干燥的磷酸肽重悬于 200 μL 50% ACN、0.1% TFA 中。涡旋并以 10,000 x g 离心 30 秒。重复此 1 次以充分重悬它们。
2. 制备容量为 200 μL 样品的吸头中包含的 TiO₂ 微珠。
   1. 轻轻敲击吸头的小尖端侧，将材料移动到该端。加入 200 μL 100% 乙腈冲洗吸头，然后倒置吸头并轻弹小端，将液体移向瓶盖。
   2. 使用剃须刀片切开尖端的小端，并将其放在低蛋白结合管上。（避免使用聚苯乙烯管，因为 TiO₂ 会粘在管的侧面。取下盖子并插入微量移液器以取出剩余的 ACN。用 200 μL 的 100% ACN 重复洗涤。TiO₂ 微珠现在位于低蛋白结合管中，用于以下步骤。
   3. 用 500 μL 100% ACN 2x 对 TiO₂ 进行预处理。移液以将珠子与溶剂混合。将它们以 100 x g 离心 1 分钟。
   4. 用 500 μL 0.2 M 磷酸钠缓冲液 （pH ~7） 2 次活化 TiO₂。用 300 μL 平衡缓冲液洗涤珠子 3 次。因为 TiO₂ 非常致密，所以珠子会很快沉降。
3. 将 400 μL 50% 乙腈、0.1% TFA 加入低蛋白结合管中，然后加入 84 μL 乳酸。将重悬的磷酸肽转移到低蛋白结合管中，并使用端对端旋转器在室温下孵育 1 小时。
4. 将珠子以 100 x g 离心 1 分钟以使其沉淀。用 300 μL 平衡缓冲液（表 1）洗涤它们 2 次，然后以 100 x g 的速度旋转 1 分钟。
5. 用 300 μL 冲洗缓冲液冲洗珠子 2 次。将它们转移到 0.2 μm 离心过滤器中。将它们以 1,500 x g 旋转 1 分钟。
6. 将过滤器单元转移到干净的 1.5 mL 低蛋白结合管中。用 200 μL 0.9% NH₃ 的 H₂O 溶液洗脱内容物 2 次。用 pH 试纸测量 pH 值，该值应在 10 到 11 之间。将洗脱液真空浓缩，使其干燥过夜，以蒸发氨。

表 1:缓冲液和溶液。下表显示了本协议中使用的缓冲液和溶液的组成。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 缓冲区 卷 组成 6 M 氯化胍裂解缓冲液 50 毫升 6 M 氯化胍、100 mM tris pH 8.5、10 mM 三（2-羧乙基）膦、40 mM 氯乙酰胺、2 mM 原钒酸钠、2.5 mM 焦磷酸钠、1 mM β-甘油磷酸酯、500 mg 正辛基糖苷、超纯水至体积 100 mM 焦磷酸钠 50 毫升 2.23 g 焦磷酸钠十水合物，超纯水至体积 1M β-甘油磷酸酯 50 毫升 15.31 g β-甘油磷酸酯，超纯水试容 5% 三氟乙酸 20 毫升 将 1 mL 100% 三氟乙酸加入 19 mL 超纯水中 0.1% 三氟乙酸 250 毫升 将 5 mL 5% 三氟乙酸加入 245 mL 超纯水中 pY 洗脱缓冲液 250 毫升 0.1% 三氟乙酸、40% 乙腈、超纯水至体积 pST 洗脱缓冲液 250 毫升 0.1% 三氟乙酸、50% 乙腈、超纯水至体积 IP 结合缓冲液 200 毫升 50 mM tris pH 7.4,50 mM 氯化钠，超纯水至体积 25 mM 碳酸氢铵，pH 7.5 10 毫升 将 19.7 mg 溶于 10 mL 无菌超纯水中，pH 值为 7.5，加入 1 N 盐酸（~10-15 μL/10 ml 溶液），制成新鲜水 1M 磷酸盐缓冲液，pH 7 1,000 毫升 423 mL 1 M 磷酸二氢钠，577 mL 1 M 磷酸氢钠 平衡缓冲液 14 毫升 6.3 mL 乙腈、280 μL 5% 三氟乙酸、1740 μL 乳酸、5.68 mL 超纯水 冲洗缓冲液 20 毫升 9 mL 乙腈、400 μL 5% 三氟乙酸、10.6 mL 超纯水 质谱解决方案 10 毫升 500 μL 乙腈、200 μL 5% 三氟乙酸、9.3 mL 超纯水 缓冲液 A 250 毫升 5 mM 磷酸二氢钾 （pH 2.65）、30% 乙腈、5 mM 氯化钾、超纯水至体积 缓冲区 B 250 毫升 5 mM 磷酸二氢钾 （pH 2.65）、30% 乙腈、350 mM 氯化钾、超纯水（体积） 0.9% 氢氧化铵 10 毫升 300 μL 29.42% 氢氧化铵，9.7 mL 超纯水