基因工程小鼠模型中的前列腺癌建模:小鼠前前列腺叶细胞中的 CRISPR/Cas9 介导的局部基因编辑技术

摘要

来源:Riedel， M. et al.CRISPR 病毒递送指南到小鼠前列腺以进行基因改变。J. Vis. Exp.（2018 年）

该视频介绍了一种使用基于腺病毒的递送系统编辑前列腺细胞中特定基因的方法。该方法允许利用 CRISPR 技术对基因表达进行原位和局部改变，以开发用于前列腺癌的新型小鼠模型。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 将病毒输送到小鼠前列腺

1. 用无菌 1 mL 注射器和 27G x 1/2" 针头腹膜内注射麻醉动物。使用 0.01 mL/g 体重的麻醉剂量。如果手术持续时间超过 30 分钟，则每 30 分钟注射 1/3 的起始剂量以保持麻醉。
2. 通过评估肌肉松弛、踏板撤退和睑反射来检查麻醉深度。当观察到反射丧失时，剃掉动物的下腹部。
3. 使用无菌棉签小心地用兽用眼药膏覆盖动物的眼睛，以防止因缺乏角膜反射而失明。
4. 用 70% 乙醇和 10% 聚维酮碘擦拭剃光的腹部，对手术区域进行消毒。从手术区域的中心向外围擦洗手术区域。
5. 使用无菌手术剪刀在约 1 cm 的下腹中线处进行垂直皮肤切口。
6. 使用细尖镊子提起腹膜，以防止损坏位于下面的器官。用手术剪刀小心地穿过腹膜切开一个 <8 毫米的切口。
   注:与人类相比，啮齿动物的前列腺由四个独立的肺叶组成。前叶附着在精囊上。
7. 轻轻将脂肪组织移到一边，露出精囊。使用环形镊子小心地提起精囊，直到可以识别前前列腺（图1）。
8. 使用带有 30G x 8 mm 针头的 0.5 mL 胰岛素注射器，将总体积为 30 μL 病毒（3 x 10¹⁰ 病毒颗粒）溶液注射到前列腺前上皮中。最大限度地减少泄漏并确保液体在组织内被吸收，形成一个小气泡。将精囊放回腹腔。
9. 使用 6-0 根可吸收缝合线，用 13 毫米、3/8 圆圈和锥形尖针，用 2-3 次简单的间断缝合腹膜。
10. 用三个无菌的 4.8 x 6.5 毫米夹子钉住皮肤，用镊子提起皮肤，以免损坏腹膜。
11. 为了更好地恢复，使用无菌 1 mL 注射器和 27G x 1/2" 针头通过腹膜内注射，以 0.01 mL/g 体重的剂量涂抹麻醉解毒剂。小心地将动物放回笼子里。

结果

图 1:程序图示。该程序在 Platt 等人产生的 Rosa26-LSL-Cas9-EGFP 小鼠中进行。前前列腺 （AP） 附着在精囊 （SV） 上。将表达向导 RNA 和 Cre 蛋白的病毒颗粒注射到前前列腺中以改变基因表达。

材料