利用基因工程小鼠模型模拟前列腺癌：一种通过CRISPR/Cas9介导的局部基因编辑技术在小鼠前叶前列腺细胞中的应用

摘要

来源：Riedel, M. 等. 利用病毒递送CRISPR向导RNA至小鼠前列腺以实现基因修饰。 J. Vis. Exp. (2018)

本视频介绍了一种利用腺病毒递送系统在前列腺细胞中编辑特定基因的方法。该方法可实现基因表达的原位和局部调控，结合CRISPR技术，用于构建新型的小鼠前列腺癌模型。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 小鼠前列腺的病毒递送

1. 使用无菌1 mL注射器和27G × ½"针头通过腹腔注射对动物进行麻醉，麻醉剂剂量为0.01 mL/g体重。若操作持续时间超过30分钟，每30分钟追加初始剂量的1/3以维持麻醉状态。
2. 通过评估肌肉松弛度、足底回缩反射和眼睑反射来判断麻醉深度。当观察到反射消失时，剃除动物下腹部的毛发。
3. 使用无菌棉签将兽用眼科软膏小心涂抹于动物眼部，以防止因角膜反射缺失导致失明。
4. 用70%乙醇和10%聚维酮碘擦拭脱毛后的腹部，以消毒手术区域。从手术区域中心向外周擦拭消毒。
5. 使用无菌手术剪在腹部中线下段做长约1 cm的垂直皮肤切口。
6. 用精细尖头镊子提起腹膜，以避免损伤其下方的器官。小心地进行切开 <使用手术剪刀经腹膜做8 mm切口。
   注意与人类不同，啮齿类动物的前列腺由四个独立的叶组成。前叶与精囊腺相连。
7. 轻轻移开脂肪组织，暴露精囊。使用环形镊子小心提起精囊，直至可辨认前叶前列腺。图1）。
8. 使用0.5 mL胰岛素注射器和30G × 8 mm针头，向前列腺前叶上皮内注射总体积为30 µL的病毒溶液（3 × 10¹⁰个病毒颗粒）。尽量减少泄漏，确保液体被组织吸收并形成一个小气泡。将精囊复位至腹腔内。
9. 使用6-0可吸收缝线，配以13 mm、3/8圆、锥形针尖的缝针，通过2-3个单纯间断缝合缝合腹膜。
10. 用无菌的 4.8 x 6.5 mm 皮肤缝合钉将皮肤固定，用镊子提起皮肤以避免损伤腹膜。
11. 为获得更好的恢复效果，使用无菌1 mL注射器和27G × ½"针头，按0.01 mL/g体重剂量通过腹腔注射给予麻醉拮抗剂。小心将动物放回其笼中。

结果

图 1：实验流程示意图。 本实验在 Platt et al 构建的 Rosa26-LSL-Cas9-EGFP 小鼠中进行。前前列腺（AP）与精囊（SV）相连。表达向导 RNA 和 Cre 蛋白的病毒颗粒被注射至前前列腺，以改变基因表达。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J 小鼠	杰克逊实验室	26175
0.5 ml U-100 胰岛素注射器	BD	324825	用于病毒注射
1 ml 注射器	BD	300013	用于麻醉注射
30 G 1/2'' 针头	BD	304000	用于麻醉注射
6-0 Polysorb 缝合线	美敦力	GL889	用于缝合腹膜
一次性无菌手术巾	多家供应商
加热垫	多家供应商
聚维酮碘消毒垫	菲舍尔科技	06-669-70
剃毛机	Aesculap	GT415	用于腹部剃毛
Dumont 镊子	F.S.T	11252-00
Halsey 微型持针器	F.S.T	12500-12
虹膜剪	F.S.T	14094-11
窄齿镊	F.S.T	11002-12
环形镊	F.S.T	11106-09
伤口缝合钉系统手柄含<br/> 缝合钉	F.S.T	12030-01	用于闭合皮肤
伤口缝合钉拆除器	F.S.T	12030-04
1× PBS	Gibco	10010-023
Antisedan			由动物设施提供
丁丙诺啡			由动物设施提供
美托咪定盐酸盐			由动物设施提供
咪达唑仑			由动物设施提供
100% 乙醇	菲舍尔科技	22-032-103
眼药膏	武田	7242
病毒（AAV，AV）	多家供应商		本方案中使用的病毒为实验室自制