基因组DNA的亚硫酸氢盐转化：一种研究胃肠道癌组织基因组DNA样本中DNA甲基化的方法

摘要

来源：Bonetto, A. 等. 结肠-26 癌移植小鼠模型在癌症恶病质研究中的应用. J. Vis. Exp. (2016)

本视频演示了对胃肠道癌样本基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰的实验步骤。该技术有助于研究基因甲基化模式与癌症发生之间关系，并明确其在致癌过程中的作用。

方案

1. 亚硫酸氢盐处理

1. 取45 µL消化后的组织溶液作为样本。
2. 使用甲基化转化试剂盒中的试剂，按照制造商提供的说明进行亚硫酸氢盐处理（参见材料表）。
   1. 向DNA样本中加入5 µL稀释缓冲液，在37 °C下孵育15分钟（参见材料表）。
   2. 在样本孵育期间，向一管CT转化试剂中加入750 µL dH₂O和210 µL稀释缓冲液，配制甲基化转化试剂（参见材料表）。通过涡旋振荡混合10分钟。
   3. 孵育15分钟后，向每个样本中加入100 µL配制好的CT转化试剂，通过反复倒置混匀。
   4. 将样本避光置于50 °C孵育12至16小时。
   5. 孵育结束后，取出样本并置于冰上冷却10分钟。
   6. 向每个样本中加入400 µL结合缓冲液，通过移液器反复吹打混匀（参见材料表）。将每个样本加载至离心柱中，并将离心柱放入2 mL收集管中（参见材料表）。
   7. 以最高速度（10,000 x g）离心1分钟，弃去穿流液。
   8. 向每个离心柱中加入200 µL洗涤缓冲液，以最高速度离心1分钟，弃去穿流液（参见材料表）。
   9. 向每个离心柱中加入200 µL脱磺酸化缓冲液，室温静置15分钟（参见材料表）。孵育结束后，以最高速度离心1分钟，弃去穿流液。
   10. 向每个离心柱中加入200 µL洗涤缓冲液，以最高速度离心1分钟（参见材料表）。
   11. 重复此步骤一次。
   12. 向每个离心柱中加入46 µL dH₂O，并将每个离心柱转移至新的无菌1.5 mL一次性聚丙烯管中（参见材料表）。离心2分钟以洗脱DNA。
3. 从一次性聚丙烯管中取出每个离心柱并丢弃（参见材料表）。此时DNA已可用于后续分析。

2. 定量甲基化特异性PCR（qMSP）

1. 使用步骤1.3中获得的亚硫酸氢盐修饰DNA作为模板，通过基于荧光的实时定量PCR（qMSP）检测每个基因分析中启动子区域的甲基化状态。
2. 使用96孔实时定量PCR仪进行qMSP（参见 材料表）。
   1. 利用200 nM正向引物、200 nM反向引物和80 nM探针，检测亚硫酸氢盐修饰DNA中目标基因的启动子甲基化状态。配制主混合液，包含16.6 mM (NH₄)₂SO₄、67 mM Tris（pH 8.8）、10 mM β-巯基乙醇、10 nM荧光素、每种脱氧三磷酸核苷酸（dNTP）0.166 mM，以及0.04 U/μl DNA聚合酶（参见 材料表）。所有检测反应每孔终体积为25 μL。
   2. qMSP扩增循环程序如下：95 °C预变性5分钟，随后进行55个循环，每个循环包括95 °C变性15秒、60 °C退火1分钟、72 °C延伸1分钟。
      注意：目标基因的选择应基于以下标准：具有较大的β值、与启动子区域的CpG岛相关，并且适用于qMSP引物和探针的设计。
3. 使用经CpG甲基转移酶（M.SssI）处理的人基因组DNA作为甲基化阳性对照（参见 材料表）。
   注意：甲基化的最终定量定义为相对甲基化值（RMV），其计算方法为每个甲基化检测重复样本相对于β-肌动蛋白（ACTB）平均Ct值的2^–ΔΔCt 。引物和探针序列见 表1。对于未检测到的重复样本，Ct值设为100，从而使2^–ΔΔCt 接近于零。计算公式如下：
   均值2^–ΔΔCt （RMV）= (2^{–ΔΔCt_重复1} + 2^{–ΔΔCt_重复2} + 2^{–ΔΔCt_重复3})/3。

基因	上游引物 5' - 3'	下游引物 5' - 3'	探针
B-ACTIN	TAG GGA GTA TAT AGG TTG GGG AAG TT	AAC ACA CAA TAA CAA ACA CAA ATT CAC	\56-FAM\ TGT GGG GTG \ZEN\ GTG ATG GAG GAG GTT TAG \3IABkFQ\
EPB41L3	GGG ATA GTG GGG TTG ACG C	ATA AAA ATC CCG ACG AAC GA	AAA TTC GAA AAA CCG CGC GAC GCC GAA ACC A

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(NH4)2SO4	Sigma-Aldrich	14148
10% 十二烷基硫酸钠 (SDS)	Quality Biological	351-032-721 EA
100% 乙醇	Sigma-Aldrich	24194
ABI StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统	Applied BioSystems	4376600	96 孔实时荧光定量 PCR 仪器
CT 转化试剂	Zymo Research	D5001-1
脱氧核苷三磷酸 (dNTP)	Invitrogen	10297-018
DEPC 处理水	DEPC 处理水	351-068-131
乙二胺四乙酸 (EDTA)	Corning	46-034-CL
EZ DNA 甲基化试剂盒	Zymo Research	D5002
人基因组 DNA	New England Bio Labs	N4002S
Infinium 人 DNA 甲基化 450 检测试剂盒	Illumina	WG-314	用于复杂评估 DNA 甲基化状态的芯片平台，可检测基因组中超过 >450,000 个 CpG 位点的甲基化状态
Light Cycler 480	Roche	5015278001
M-结合缓冲液	Zymo Research	D5002-3
M-脱磺酸缓冲液	Zymo Research	D5002-5
M-稀释缓冲液	Zymo Research	D5002-2
M-洗涤缓冲液	Zymo Research	D5002-4
蛋白酶 K	New England Biolabs	P8107S
一次性聚丙烯 (Eppendorf) 管	Eppendorf	24533495
Tris 盐酸 (Tris-HCl) 2 M pH 8.8	Quality Biological	351-092-101
Zymo Spin 1 柱	Zymo Research	C1003
β-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M3148
荧光素	Bio-Rad	#1708780
Platinum Taq 聚合酶	ThermoFisher Scientific	10966-034