基因组 DNA 的亚硫酸氢盐转化:一种研究胃肠道癌症组织基因组 DNA 样本中 DNA 甲基化的方法

摘要

来源:Bonetto， A. et al.结肠 26 癌荷瘤小鼠作为癌症恶病质研究的模型。J. Vis. Exp.（2016 年）

该视频演示了对胃肠道癌症样本中的基因组 DNA 进行亚硫酸氢盐修饰的过程。该技术有利于研究基因甲基化模式之间的关系并确定它们对致癌作用的贡献。

方案

1. 亚硫酸氢盐处理

1. 使用 45 μL 消化的组织溶液作为样品。
2. 根据制造商的说明，使用亚硫酸氢盐转化试剂盒中的试剂进行亚硫酸氢盐处理（参见材料表）。
   1. 向 DNA 样品中加入 5 μL 稀释缓冲液，并在 37 °C 下孵育 15 分钟（参见材料表）。
   2. 在孵育样品时，向一管 CT 转化试剂中加入 750 μL dH₂O 和 210 μL 稀释缓冲液来制备亚硫酸氢盐转化试剂（参见材料表）。涡旋 10 分钟，混合试管。
   3. 孵育 15 分钟后，向每个样品中加入 100 μL 制备的 CT 转化试剂，倒置混合。
   4. 将样品在 50 °C 的黑暗中孵育 12 至 16 小时。
   5. 孵育后，取出样品并置于冰上 10 分钟。
   6. 加入 400 μL 结合缓冲液，通过上下吹打混合每个样品（参见材料表）。将每个样品加载到离心柱中，然后将柱放入 2 mL 收集管中（参见材料表）。
   7. 将每个样品全速 （10,000 x g） 离心 1 分钟，然后丢弃流出液。
   8. 向每根色谱柱中加入 200 μL 洗涤缓冲液，全速旋转 1 分钟，丢弃流出液（参见材料表）。
   9. 向每根色谱柱中加入 200 μL 脱磺缓冲液，让色谱柱在室温下静置 15 分钟（参见材料表）。孵育后，全速旋转色谱柱 1 分钟，然后丢弃流出液。
   10. 向每根色谱柱中加入 200 μL 洗涤缓冲液，并全速旋转 1 分钟（参见材料表）。
   11. 再重复一次此步骤。
   12. 向每根色谱柱中加入 46 μL dH₂O，并将每根色谱柱放入新的无菌 1.5 mL 一次性聚丙烯管中（参见材料表）。离心每管 2 分钟以洗脱 DNA。
3. 从一次性聚丙烯管中取出每个离心柱并丢弃（参见材料表）。DNA 现在已准备好进行分析。

2. 定量甲基化特异性 PCR （qMSP）

1. 使用步骤 1.3 中的亚硫酸氢盐修饰的 DNA 作为模板，在 qMSP 中进行基于荧光的实时 PCR，以评估每个基因分析中启动子区域的甲基化。
2. 使用 96 孔实时 PCR 仪器进行 qMSP（参见材料表）。
   1. 使用 200 nM 正向引物、200 nM 反向引物和 80 nM 探针检查亚硫酸氢盐修饰的 DNA 上靶基因的启动子甲基化状态。用 16.6 mM （NH₄）₂SO₄、67 mM Tris pH 8.8、10 mM β-巯基乙醇、10 nM 荧光素、0.166 mM 每种脱氧核苷酸三磷酸和 0.04 U/μl DNA 聚合酶制备预混液（参见材料表）。所有测定的每个孔中的最终反应体积为 25 μL。
   2. 按如下方式执行 qMSP 循环:95 °C 5 分钟，然后是 95 °C 15 秒、60 °C 1 分钟和 72 °C 1 分钟的 55 个循环。
      注:应根据具有较大 β 值、与启动子区域中的 CpG 岛相关以及适合 qMSP 引物和探针设计的标准来选择靶基因。
3. 使用经 CpG 甲基化酶 （M.SssI） 处理的人基因组作为阳性甲基化对照（参见材料表）
   注意:甲基化的最终定量定义为相对甲基化值 （RMV），计算为每个甲基化检测重复的 ^2-ΔΔCt，与 β-肌动蛋白 （ACTB） 的平均 Ct 相比。引物和探针序列如表 1 所示。Ct 为 100 用于未检出的重复，得到 2^–ΔΔCt 的值接近于零。使用以下公式:
   平均值 2^–ΔΔCt （RMV） = （2^–ΔΔ Ct_replicate_1 + 2^–ΔΔ Ct_replicate_2 + 2^–ΔΔ Ct_replicate_3）/3。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 基因 前锋 5' - 3' 反向 5' - 3' 探针 B-肌动蛋白 标签 GGA GTA TAT AGG TTG GGG AAG TT AAC ACA CAA TAA CAA ACA ACA ACA ATT CAC \56-FAM\ TGT GGG GTG \ZEN\ GTG ATG GAG GAG GTT TAG \3IABkFQ\ EPB41L3 GG ATA GTG GGG TTG ACG C ATA AAA ATC CCG ACG AAC GA AAA TTC GAA AAA CCG CGC GAC GCC GAA ACC A

材料