基于玻璃化法的冷冻保存：一种超快速冷却技术，用于在极低温度下长期保存生物样本

摘要

来源：Lu, J. H. 等. 胃癌患者来源的异种移植模型及原代细胞系的建立。J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们演示了一种用于保存生物样本的超快速冷冻玻璃化方法。该方法通过使用多种冷冻保护剂的组合，防止细胞内冰晶形成，从而保护生物组织免受冷冻损伤。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 组织冷冻保存

注意：本部分主要参考活体组织冷冻试剂盒的操作方法。主要试剂盒和设备列于 材料表中。

1. 当肿瘤直径超过10 mm时，采用经伦理审查委员会（IRB）批准的方法对小鼠实施安乐死。
2. 使用无菌镊子和剪刀，缓慢从小鼠体内分离肿瘤组织。
3. 在10 cm培养皿中用DPBS清洗肿瘤组织，使用镊子和剪刀解剖并去除坏死区域、脂肪组织、血凝块及结缔组织。
4. 使用模具将肿瘤组织切成最大厚度为1 mm的切片。
5. 在10 cm培养皿中用DPBS清洗切片。
   注意： 玻璃化冷冻过程涉及在步骤1.6–1.8中使用标记为V1/V2/V3的试管，其主要成分为DMSO和蔗糖。
6. 用镊子将切片转移至V1管中，在4 °C孵育4分钟；短暂滚动并倒置试管，再于4 °C放置4分钟。
7. 将V1溶液和切片倒入10 cm培养皿中，用镊子将切片转移至V2管中，在4 °C孵育4分钟；短暂滚动并倒置试管，再于4 °C放置4分钟。
8. 将V2溶液和切片倒入10 cm培养皿中，用镊子将切片转移至V3管中，在4 °C孵育5分钟；短暂滚动并倒置试管，再于4 °C放置至少5分钟。确保所有切片均沉入管底。
   1. 若仍有数个切片漂浮，可再次短暂滚动并倒置试管，放回4 °C直至所有切片完全下沉；必要时，可弃去漂浮的切片。
9. 将V3溶液和切片倒入10 cm培养皿中。
10. 将组织支架剪裁至适当长度，并置于无菌纱布上；用镊子将切片转移至支架上，用纱布包裹支架后放入液氮中，随后孵育5分钟。
11. 在冻存管上标注组织相关信息。
12. 将带有组织切片的支架转移至冻存管中，并储存在液氮中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
活体组织试剂盒 冷冻试剂盒	Celliver Biotechnology, Shanghai, China	LT2601
组织处理模具及辅助刀片	Celliver Biotechnology, Shanghai, China	LT2603
DPBS	Basalmedia Technology, Shanghai, China	L40601