腹腔低密度中性粒细胞分离：利用磁性激活细胞分选技术从腹腔灌洗液中获取低密度中性粒细胞的方法 关键词：低密度中性粒细胞，腹腔灌洗液，磁性激活细胞分选，中性粒细胞，炎症，免疫细胞分离

摘要

来源：Kanamaru, R. 等. 腹腔灌洗液中低密度中性粒细胞产生的中性粒细胞胞外诱捕网介导肿瘤细胞的生长与黏附。J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中，我们介绍了从术后人类患者的腹腔灌洗液中分离低密度中性粒细胞（LDN）的操作步骤。所获得的LDN可用于后续实验，以深入研究其在肿瘤生长与进展中的作用。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 从腹腔灌洗液中分离低密度中性粒细胞

1. 样本获取
   1. 在因胃肠道恶性肿瘤接受腹部手术的患者中，于关闭切口前将 1,000 mL 无菌生理盐水直接注入腹腔。
      注意：样本来源于接受胃切除术、结肠切除术或食管切除术的患者，未根据年龄或性别进行偏倚选择。将生理盐水转移至容器中，并在一分钟内倾倒至整个腹腔。此操作常规作为术后腹腔冲洗，对患者无明显影响。
   2. 广泛冲洗腹腔至少 1 分钟。
      注意：建议由外科医生用手缓慢搅动注入的液体，以确保样本均匀。
   3. 使用四个 50 mL 注射器回收 200 mL 冲洗液。
      注意：有时使用橡胶连接器来收集液体。
2. 使用粒细胞特异性单克隆抗体 CD66b 对腹腔低密度中性粒细胞（peritoneal LDN）进行纯化
   注意：由于密度梯度离心后中间层含有大量单核细胞，因此采用 CD66b 单克隆抗体对多形核中性粒细胞进行阳性筛选。
   1. 将腹腔冲洗液转移至 50 mL 离心管中。
      注意：此步骤中，需使液体通过 100 µm 尼龙滤膜以去除杂质。
   2. 在室温下以 270 × g 离心 7 分钟。
   3. 将沉淀物重悬于含 0.02% EDTA 的 5 mL PBS 中。
   4. 小心地将 5 mL 细胞悬液铺于 3 mL 密度梯度溶液上层。
   5. 在室温下以 1,700 × g 离心 15 分钟，期间不得刹车。
   6. 用移液器收集约 2 至 3 mL 含中间层的溶液（图 1A），并与含 0.02% EDTA 的 10 mL PBS 混合。
   7. 在室温下以 400 × g 离心腹腔液 7 分钟，弃去上清液。
   8. 加入另一份含 0.02% EDTA 的 10 mL PBS，于室温下以 270 × g 离心 7 分钟，弃去上清液。
   9. 将细胞沉淀（1 × 10⁷）溶解于 60 µL 磁性细胞分选试剂盒缓冲液中。
   10. 向沉淀中加入 20 µL Fc 封闭剂，在 4 °C 下孵育 10 分钟。
   11. 加入 20 µL 与微珠偶联的抗 CD66b 抗体，在 4 °C 下继续孵育 10 分钟。
   12. 用 500 µL MACS 缓冲液洗涤并重悬沉淀物。
   13. 将细胞悬液加入置于合适磁力分选器磁场中的磁性柱内，用 15 mL 缓冲液冲洗柱子，收集流出液中的 CD66b(-) 细胞。
   14. 从磁力分选器上取下磁性柱，立即用力推动柱塞，将磁性标记的 CD66b(+) 细胞冲出。
       注意：通过流式细胞术分析确定，CD66b(+) 细胞群体主要为中性粒细胞，其中 >95% 的 CD66b(+) 细胞表达 CD11b、CD15 和 CD16，但不表达 CD14。

结果

图1：腹腔LDN培养后NET的形成。（A） 术后灌洗液经密度梯度离心后，显示从中间层回收的细胞。（B） 随后，将CD66b(+) LDN从CD66b(-)单个核细胞中分离，并接种于多聚-L-赖氨酸包被的6孔板中培养，加入细胞核染色染料后立即进行荧光显微镜观察。（C） 在相同条件下培养相同数量的CD66b(-)单个核细胞。（D） LDN单层细胞在加入核染色剂前，先用DNase I孵育5分钟。（E） CD66b(+) LDN接种于未经包被的塑料培养板上培养。白色标尺代表100

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare，瑞典	17-1440-02
StraightFrom™ 全血 CD66b 微珠	Miltenyi Biotec，德国贝尔吉施格拉德巴赫	130-104-913
Fc 封闭剂	Miltenyi Biotec，德国贝尔吉施格拉德巴赫	130-059-901
MACS 洗涤液	Miltenyi Biotec，德国贝尔吉施格拉德巴赫	130-091-222
0.5 mol/L EDTA 溶液（pH 8.0） 	Nacalai Tesque，日本 	06894-14
MACS BSA 储存液	Miltenyi Biotec，德国贝尔吉施格拉德巴赫	130-091-376
LS 分离柱	Miltenyi Biotec，德国贝尔吉施格拉德巴赫	130-041-306
MACS 磁性分离器	Miltenyi Biotec，德国贝尔吉施格拉德巴赫	130-042-501