中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的荧光显微镜观察：一种用于观察癌细胞与NETs之间黏附相互作用的技术

摘要

来源：Kanamaru, R. 等. 由腹腔灌洗液中低密度中性粒细胞产生的中性粒细胞胞外诱捕网介导肿瘤细胞的生长与黏附。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的荧光染色，NETs 是中性粒细胞释放的胞外 DNA 成分。该技术能够实现癌细胞与 NETs 之间黏附相互作用的可视化。

方案

1. 使用红色荧光细胞连接染料对肿瘤细胞进行染色

1. 准备人源癌细胞系 MKN45、NUGC 和 OCUM-1。
2. 在 15 mL 离心管中用含 0.02% EDTA 的 PBS 洗涤 1 × 10⁷  个细胞，并在室温下以 270 × g 离心 7 分钟。
3. 向细胞沉淀中加入 1 mL 染色用溶液，轻轻吹打混匀。
4. 将 4 µL 红色荧光细胞连接染料溶解于 1 mL 染色溶液中，与步骤 1.2得到的细胞悬液混合。
5. 在室温下孵育细胞沉淀 4 分钟。
6. 加入 4 mL DMEM（含 10% FBS）以终止染色反应。
7. 以 270 × g 离心 7 分钟，弃去上清液。
8. 重复步骤 1.6和步骤 1.7两次。
9. 使用荧光显微镜（激发波长 = 551 nm，发射波长 = 567 nm）检查肿瘤细胞是否被染成红色。

2. 肿瘤细胞与中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）黏附性的分析

1. 在37 ˚C、5% CO₂条件下，将低密度中性粒细胞接种于6孔聚-L-赖氨酸包被培养板（直径6 cm）中培养2小时₂，可促进中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的形成
2. 将红色荧光标记的肿瘤细胞（1 × 10⁶) 加入1 mL含0.1% BSA的RPMI 1640培养基中。
3. 将肿瘤细胞加入产生中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的低密度中性粒细胞（LDN）培养物中。
4. 在37 ˚C孵育5分钟，使肿瘤细胞与中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）接触。
   注意： 长时间孵育可诱导肿瘤细胞黏附于LDN或培养板上。
5. 吸除培养基，加入2 mL预热的培养液（0.1% BSA + RPMI 1640），轻轻晃动培养皿，洗涤孔内。
6. 重复上述洗涤步骤 步骤 2.5 两次。
   注意： 由于NETs与培养板的结合较弱，洗涤时应尽量轻柔，以避免将NETs本身洗脱。
7. 加入绿色荧光染料，终浓度为 5 µg/mL，用于染色细胞核和染色体，以便观察 NETs。
8. 使用适当的滤光片观察NETs及附着的肿瘤细胞（绿色，激发波长 = 504 nm，发射波长 = 523 nm；红色，激发波长 = 551 nm，发射波长 = 567 nm）。
9. 合并图像以显示被中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）捕获的肿瘤细胞。
   注意： 在某些实验中，在共孵育前5分钟向LDN培养物中加入DNA降解酶（终浓度为100 U/mL），共孵育时间为5分钟。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SYTOX Green 核酸染料，5 mM DMSO 溶液	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S7020
PKH26 红色荧光细胞连接试剂盒，用于通用细胞膜标记	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	P9691
RPMI1640 培养基	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	R8758
牛血清白蛋白，冻干粉末，≥96%（琼脂糖凝胶电泳）	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	A2153
聚-L-赖氨酸包被 6 孔显微培养板	IWAKI, Japan	4810-040
荧光体视显微镜	BX8000, Keyence, Osaka Japan	BZ-X710
MKN45 人胃癌细胞系	Riken, Tukuba Japan	N/A
NUGC-4 人胃癌细胞系	Riken, Tukuba Japan	N/A
OCUM-1 人胃癌细胞系	Osaka City University, Japan	N/A	由 M. Yashiro 博士惠赠
DNase I	Worthington, Lakewood NJ	LS002138
0.5 mol/L EDTA 溶液（pH 8.0）	Nacalai Tesque, Japan	06894-14
杜尔贝科改良伊格尔培养基-高糖（DMEM）’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	D5796