延时荧光显微镜观察中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）：一种用于分析癌细胞与NETs黏附后相互作用的技术

摘要

来源：Kanamaru, R. 等. 由腹腔灌洗液中获得的低密度中性粒细胞产生的中性粒细胞胞外诱捕网介导肿瘤细胞的生长与黏附. J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中，我们通过共培养低密度中性粒细胞和胃癌细胞，分析被中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）捕获的癌细胞在黏附后的生物学行为。利用延时视频分析技术，可动态监测多种细胞事件，进而研究NETs在病理条件下的作用。

方案

1. 捕获肿瘤细胞的时间延时视频分析

1. 将腹膜LDN细胞接种于经多聚赖氨酸包被的35 mm圆形培养皿中，于37 ˚C、5% CO₂条件下孵育2小时。
2. 加入绿色荧光染料以染色细胞核和染色体，用于可视化中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），终浓度为5 µM。
3. 孵育1分钟后，吸除培养基，加入2 mL含0.1% BSA的RPMI 1640培养基。
4. 吸除培养基，加入未染色的MKN45细胞悬液（1 × 10⁶ 个细胞），用含0.1% BSA的RPMI 1640培养基重悬，室温孵育5分钟。
5. 通过轻轻加入2 mL预热的培养基（0.1% BSA + RPMI 1640）并轻柔旋转培养皿，洗去未贴壁的肿瘤细胞。
6. 重复上述洗涤步骤两次。
   注意：由于NETs与培养皿的结合较弱，洗涤操作应尽可能轻柔，以避免将NETs本身洗脱。
7. 加入含10%胎牛血清（FCS）的DMEM培养基，并补充100 u/mL青霉素和100 µg/mL链霉素。
8. 将培养皿安装至全视野活细胞观察系统，选择NETs捕获肿瘤细胞的合适视野。
9. 继续共培养两天，每隔6分钟在明场光和荧光下连续拍摄该视野图像，分别用于检测MKN45细胞和NETs。
10. 对每个时间点的....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SYTOX green 核酸染料，5 mM DMSO 溶液	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S7020
RPMI1640 培养基	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	R8758
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基-高糖（DMEM）	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	D5796
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（DPBS）	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	D8537
胎牛血清，经认证，符合美国农业部批准地区标准	gibco by life technologies, Mexico	10437-028
牛血清白蛋白，冻干粉末，≥96%（琼脂糖凝胶电泳检测）	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	A2153
青霉素-链霉素	Life Technologies Japan	15140-122
Plasmocin 预防性试剂	InvivoGen, San Diego, CA-USA	ant-mpp
荧光体视显微镜	BX8000, Keyence, Osaka Japan	BZ-X710
全视野细胞观察系统	Nikon, Kanagawa, Japan	BioStudio (BS-M10)
MKN45 人胃癌细胞系	Riken, Tukuba Japan	N/A