外泌体阻断剂制备：一种保存培养的人结肠癌细胞外泌体的实验方案

摘要

来源：Jung, M. K. 等. 外泌体透射电子显微镜样品制备与成像. J. Vis. Exp. (2018)

本视频介绍了从培养的胃肠道肿瘤细胞中制备外泌体包埋块的技术。这些外泌体包埋块可进一步切片、染色并成像，以确定脂质双分子层囊泡中外泌体特定蛋白质的定位。

方案

1. 外泌体的制备

1. 通过在 100,000 × g 条件下离心 1.5 小时，从 HCT116 细胞的培养上清液中沉淀外泌体。弃去培养上清液，用 1 mL 含 2.5% 戊二醛的 0.1 M 二甲胂酸钠溶液（pH 7.0）在 4 °C 下固定纯化的外泌体沉淀 1 小时。配制 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液时，将 4.28 g 二甲胂酸溶解于 160 mL 去离子水中，用 0.1 M HCl 调节 pH 至 7.4，再加去离子水定容至 200 mL。
2. 弃去固定液，用 1 mL 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液在室温下冲洗沉淀物。重复冲洗三次，每次 10 分钟。
3. 用 1 mL 2% 四氧化锇在 4 °C 下对样品进行后固定 1 小时。
4. 弃去固定液，每隔 10 分钟用 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液冲洗一次，共冲洗三次。
5. 在摇床上依次使用梯度丙酮溶液（分别为 50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%）处理 10 分钟。
6. 弃去丙酮，加入 3:1 的丙酮与低黏度包埋剂混合液，孵育 30 分钟。外泌体沉淀位于离心管中。
7. 弃去液体，加入 1:1 的丙酮与低黏度包埋剂混合液，孵育 30 分钟。
8. 弃去液体，加入 1:3 的丙酮与低黏度包埋剂混合液，孵育 30 分钟。
9. 弃去液体，加入 100% 低黏度包埋剂，室温下孵育过夜。
10. 将样品置于包埋模具中，用纯低黏度包埋剂包埋，并在 65 °C 下烘烤 24 小时。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
戊二醛	EMS	16200
二甲胂酸钠	EMS	12300
四氧化锇 1 g 晶体	EMS	19100	仅可在通风橱中使用
丙酮	JUNSEI	1B2031