外泌体切片的金免疫染色：一种可视化外泌体腔内诊断标志物的技术

摘要

来源：Jung, M. K., Mun, J. Y. 外泌体的透射电子显微镜样品制备与成像。J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中，我们展示了对定位于超薄外泌体切片腔室区域内的生物标志物进行胶体金免疫染色的方法。该技术通过可视化病变细胞所分泌的外泌体中的靶分子，实现疾病的早期诊断。

方案

1. 外泌体切片的免疫染色与成像

1. 使用超薄切片机制备外泌体包埋块的60 nm超薄切片，并将其收集于镍网上。
2. 将镍网置于50 µL的0.02 M甘氨酸溶液中孵育10分钟，以淬灭游离醛基。
3. 用100 μL去离子水（DW）清洗三次，每次10分钟。随后在含1% BSA的PBS中室温孵育1小时。
4. 将镍网置于50–100 µL的抗KRS抗体溶液（以含0.1% BSA的PBS按1:100稀释）中孵育1小时（如有必要，可在4 °C下过夜孵育）。
5. 用含0.1% BSA的PBS溶液洗涤镍网，共五次，每次使用50 µL溶液，每次洗涤10分钟。
6. 将镍网转移至二抗 溶液液滴中孵育1小时（使用含0.1% BSA的PBS按1:100稀释的10 nm金标抗兔IgG抗体）。
7. 用含0.1% BSA的PBS溶液洗涤镍网，共五次，每次使用50 µL溶液，每次洗涤10分钟。
8. 分别在避光条件下用2%醋酸铀双染20分钟，再用Reynold's柠檬酸铅染色10分钟。
9. 在80 kV透射电子显微镜下观察镍网样品。
10. 在80 kV透射电镜的CCD相机系统中点击“采集”，然后点击“文件”并选择“另存为”。曝光时间采用自动设置。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
醋酸铀酰	EMS	22400	危险化学品
柠檬酸铅	EMS	17900
透射电子显微镜	日立	H7600
铜网	EMS	G200-Cu
甘氨酸	SIGMA	022K5404
磷酸盐缓冲液	SIGMA	P4417
牛血清白蛋白	Aurion	25557
纯化的抗人 CD274（B7-H1，PD-L1）抗体	BioLegend	329710	整体免疫金染色
纯化的鼠 IgG2b，κ 同型对照	BioLegend	401202	整体免疫金染色（对照）
二抗-偶联 9-11 nm 金颗粒的抗小鼠 IgG	sigma	G7652
多聚甲醛	EMS	19210