肌肉组织切片的速冻方法：一种获取快速冷冻小鼠肌肉组织超薄切片的实验方案

摘要

来源：Bonetto, A. 等 结肠-26 癌移植小鼠模型在癌症恶病质研究中的应用 J. Vis. Exp. (2016)

本视频介绍了快速冷冻肌肉组织并获取其薄切片的操作步骤。该技术有助于研究结肠癌小鼠模型中与癌症相关的恶病质。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 肌肉组织的冷冻与包埋

1. 将装有异戊烷的小型塑料烧杯（50 mL）下半部分浸入液氮中。当异戊烷变得略微粘稠，并在烧杯内壁形成白色固态层时（温度：-160 °C），即可使用。
   注意：务必使用无火花的青铜或铝制手动工具。避免吸入产品蒸气。应在通风良好的条件下使用。若处理泄漏且无法或难以实现通风时，应佩戴合适的呼吸器。
2. 将包埋介质蘸取少量于样品台（软木塞）上，然后短暂浸入异戊烷中（约10秒），使其冻结。
3. 手持肌肉（如胫骨前肌或腓肠肌）的肌腱部分，使其相对于软木塞保持垂直方向，以维持肌纤维的原有取向，并便于获得横切面。
4. 小心地将新鲜肌肉的一端放置在已冻结的包埋介质表面。
   注意：肌肉会牢固粘附。切勿用包埋介质完全包裹肌肉。同时必须保持肌肉的垂直方向，以便后续测定横截面积。
5. 将带有肌肉的样品台浸入异戊烷冷冻浴中（通常冷冻时间为7–15秒，具体时间取决于样本大小和组成）。
   注意：浸入冷冻液的时间不应超过完全冻结样本所需时间。冷冻过久会导致组织块破裂，时间过短则会引起冰晶形成。理想冻结的样本呈 chalky white（ chalky white 为专业描述，保留原文）。
6. 样本冻结后，立即放入小型塑料袋或样品管（50 mL）中，并迅速储存在-80 °C超低温冰箱或液氮中。

2. 肌肉切片

1. 将冰冻切片机内腔的工作温度设置为约 -23 °C。
2. 使标本（先前储存在 -80 °C）在工作温度下适应环境（数小时即可）。
3. 切取多个 8 μm 厚的标本切片（优先选择胫骨前肌或腓肠肌），并将切片收集到载玻片上。
   注意：应在肌肉的肌腹中部区域进行切片。 此外，为了保证准确性，切片方向应垂直于肌肉的固定轴。
4. 将载玻片保留在冰冻切片机腔体内。如果后续需进行免疫荧光/免疫组化（IF/IHC）研究或酶组织化学染色，则切勿让其解冻。
5. 将载玻片储存于 -80 °C，以备后续分析使用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
OCT	Tissue-Tek	4583
冷冻切片机	Leica	CM1850
软木圆片	Electron Microscopy Sciences	63305
Superfrost plus 玻片	VWR	48311-703