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所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 溶液的配制
- 如表1所述，配制结肠缓冲液、100%二氧化硅密度分离介质、66%二氧化硅密度分离介质、44%二氧化硅密度分离介质、胶原酶E消化缓冲液以及FACS缓冲液。
- 在实验前一天配制结肠缓冲液，并于4 °C过夜保存。
- 在实验前一天配制100%二氧化硅密度分离介质，并于4 °C过夜保存；实验当天早晨将其置于室温下解冻。
- 在细胞分离当天早晨，使用室温的100%二氧化硅密度分离介质和结肠缓冲液配制66%和44%二氧化硅分离介质。
- 测量适量来源于 Clostridium histolyticum的胶原酶E，并在实验前夜于-20 °C保存。次日早晨，将其溶解于适当体积的结肠缓冲液中，制成胶原酶消化缓冲液。实验当天所有使用胶原酶消化缓冲液的孵育步骤，均需预先将溶液升温至37 °C。
- 在整个实验流程中，设置一台离心机保持20 °C、转速859 x g、关闭刹车（0级减速），用于梯度离心；另设一台离心机保持4 °C、转速859 x g、标准减速，用于洗涤步骤。
2. 收集结肠组织
- 通过 CO2 窒息法处死小鼠，并采用 AALAC 认可的确认方法进行验证。
- 将小鼠置于仰卧位，用 70% 乙醇喷洒毛发。使用大型组织剪沿中线作垂直切口，暴露完整的腹膜。
- 使用精细解剖剪切开腹膜。用镊子将小肠推向一侧，暴露降结肠。轻轻向上牵拉降结肠，以充分暴露结肠的直肠部分。在骨盆深部切断远端直肠，将整个结肠作为一个整体从远端直肠至盲肠帽进行游离并完整切除。
- 将结肠转移至含有 20 mL 冷却的结肠缓冲液的 50 mL 聚丙烯管中。
3. 清洁结肠
- 将结肠置于湿润的纸巾上，用剪刀或镊子的钝端轻轻按压肠壁，以挤出固体粪便。
- 将结肠放入培养皿中，使用带有18G钝头灌注针的10 mL注射器，以10 mL预冷的结肠缓冲液冲洗肠道。
- 将结肠转移至用结肠缓冲液润湿的纸巾上，用剪刀的尖端去除肠系膜和脂肪组织。
- 将结肠放入盛有5–10 mL预冷结肠缓冲液的培养皿中，手动轻轻搅动以清洗残留的结肠内容物，重复2–3次。
- 在盛有新鲜预冷结肠缓冲液的培养皿中，从肌肉较发达的直肠端开始，沿纵轴将结肠切开至近端结肠（形成一块矩形的开放状结肠组织）。弃去原有液体，并重新加入干净的预冷结肠缓冲液。
- 通过在培养皿中剧烈旋转晃动结肠组织，并在每次清洗后更换5–10 mL预冷结肠缓冲液，共清洗3次。
- 将矩形结肠组织置于用结肠缓冲液润湿的纸巾上，先横向切割，再切成小块组织片段（3 mm × 3 mm大小）。
- 用精细镊子小心夹取结肠片段，转移至50 mL聚丙烯离心管中，管内含20 mL预冷结肠缓冲液。
- 每次用20 mL结肠缓冲液清洗结肠片段，共清洗三次，每次剧烈涡旋震荡离心管30秒。每次震荡后，静置使组织片段沉降至管底。每次清洗后倾倒或用真空抽吸去除上清液，注意避免抽吸过程中丢失组织片段。
注意： 每次清洗后无需更换离心管。
4. 胶原酶消化 1
- 向50 mL聚丙烯锥形管中已洗涤的结肠组织碎片加入20 mL胶原酶消化缓冲液。
- 将封闭的50 mL离心管置于37 °C的恒温振荡摇床中，转速设定为2 x g ，振荡消化60分钟。确保组织碎片在振荡过程中持续运动；如有必要，可逐步提高转速，防止组织碎片沉降至管底。
5. 制备基于二氧化硅的分离介质梯度
- 使用100%硅胶基密度分离介质和结肠缓冲液，在20 °C（室温）下配制66%和44%的硅胶基密度分离介质。
- 将5 mL的66%硅胶基密度分离介质分别加入3个独立的15 mL聚丙烯管中。每段结肠准备三根试管。此步骤形成梯度分离程序中的高密度底层，后续将叠加低密度分离介质以建立分离梯度。
- 于20 °C保存，待用。
6. 第一次消化上清液的收集
- 胶原酶消化1完成后，使用25 mL血清移液管仅收集上清液，并将上清液通过置于洁净50 mL聚丙烯离心管中的40 μm孔径过滤织物细胞滤筛进行过滤。注意避免吸入任何存在的组织碎片。
注意： 保留管中任何残留的可见组织碎片，这些组织将进行第二次胶原酶消化（步骤8）。
7. 终止胶原酶消化缓冲液反应
- 用预冷的结肠缓冲液（Colon Buffer）完全填充50 mL聚丙烯管。
注意： 胶原酶在37 °C时具有活性，因此使用预冷缓冲液可使其失活。
- 在4 °C下以800 x g 离心5分钟。
- 通过真空抽吸弃去上清液。用25 mL新鲜结肠缓冲液重悬细胞，并在800 x g 下离心5分钟。
- 将沉淀物重悬于少于1 mL的新鲜预冷结肠缓冲液中。
- 将50 mL聚丙烯锥形管置于冰上。
8. 胶原酶消化 2
- 对从步骤 6.1保留的剩余组织碎片重复步骤 4（消化 1）。
9. 消化后的组织解离 2
- 使用10 mL注射器通过18G钝端针头，将组织碎片在离心管与注射器之间用力反复冲洗。
- 至少重复冲洗7-8次完整循环，持续操作直至肉眼不可见明显的组织碎片或残渣。
10. 过滤细胞
- 将组织解离悬液通过40 μm孔径的滤膜细胞筛，滤入一个洁净的50 mL聚丙烯管中。
- 用10 mL预冷的结肠缓冲液冲洗滤膜细胞筛，以回收滤膜中截留的细胞。
11. 终止胶原酶消化反应
- 用预冷的结肠缓冲液将50 mL聚丙烯圆锥形管加至管口。
注意： 结肠缓冲液的温度至关重要，以确保终止胶原酶活性。
- 4 °C、800 x g 条件下离心 g 5 分钟。
- 通过真空抽滤弃去上清液。
- 用 25 mL 新鲜预冷的 Colon Buffer 重悬洗涤, 随后在 4 °C 下以 800 x g 离心 g 5 分钟。
- 通过真空抽吸弃去上清液。
- 合并胶原酶消化1中重新悬浮的沉淀物（步骤 7) 转移至其对应的离心管中 步骤 11.4.
- 重复 步骤 11.4 （洗涤和离心）
12. 基于二氧化硅的密度分离介质梯度分离
注意： 请尽快完成步骤 12-13，以确保迅速终止胶原酶活性。
- 在步骤 11.7之后，每根结肠样本的沉淀物用 24 mL 的 44% 二氧化硅基密度分离介质重悬。
- 使用 10 mL 血清移液管，将步骤 12.1中获得的介质缓慢地分层加入在步骤 5.2中准备好的三根试管（内含 66% 二氧化硅基密度分离介质）中，每管 8 mL。分层过程中应保持 44% 密度分离介质稳定且缓慢的流速，以避免破坏界面。
- 使用天平或平衡装置，仔细平衡所有离心管在离心桶中的重量。
- 在 20 °C 条件下，以 859 × g 的转速在无刹车模式的离心机中离心 20 分钟。离心结束后，待转子完全停止后再取出离心管，注意避免扰动梯度界面处的细胞。
13. 从密度梯度界面收集单个核细胞
- 观察梯度界面（靠近5 mL刻度处），通常可见一条1-2 mm厚的白色条带（含有单个核细胞，MNC）。
注意： 白色条带可能可见，也可能不可见。然而，单个核细胞位于该界面处，通常会使梯度界面变得浑浊，降低其透明度。
- 用真空抽吸法吸除并弃去上层梯度液顶部7 mL，以便更方便地用移液器接触界面层。
- 通过持续的手动吸力并配合稳定旋转手腕的动作，将界面层的细胞收集至一个洁净的50 mL聚丙烯圆锥形离心管中。收集至两层梯度之间的界面清晰且具有折光性（无细胞残留）为止。
- 用50 mL预冷的FACS缓冲液充满收集管，在4 °C条件下以800 × g 离心5分钟。
- 通过真空抽吸去除上清液，并将沉淀物重悬于1 mL FACS缓冲液中。
- 使用适当的死细胞排除方法，按1:2稀释比例在血细胞计数板上进行细胞计数。
- 对接收的结肠单个核细胞立即进行FACS染色或其他检测。
表1：溶液配制表
| 溶液 | 配方 |
| 结肠缓冲液 | 500 mL RPMI + 10 mM HEPES + 10% FBS（56oC 热灭活 60 分钟，pH 调至 7.3） |
| 基于二氧化硅的密度梯度介质 100% （每结肠） | 22.5 mL 基于二氧化硅的密度梯度介质 + 2.5 mL 10x PBS。 |
| 基于二氧化硅的密度梯度介质 66% （每结肠） | 10.72 mL 基于二氧化硅的密度梯度介质 100% + 5.28 mL 结肠缓冲液 |
| 基于二氧化硅的密度梯度介质 44% （每结肠） | 11 mL 基于二氧化硅的密度梯度介质 100% + 14 mL 结肠缓冲液 |
| 胶原酶消化缓冲液 （每结肠） | 来自 Clostridium histolyticum 的胶原酶 E 100 U/mL，溶于 40 mL 结肠缓冲液 |
| FACS 缓冲液 | 500 mL 1x PBS + 5 g BSA + 1 mm EDTA + 0.2 g 叠氮化钠 |