固有层单个核细胞分离：一种基于二氧化硅密度梯度离心法从小鼠结肠获取单个核细胞的技术

摘要

来源：McManus, D. 等. 使用胶原酶E从小鼠结肠分离固有层单个核细胞。J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们演示了通过使用胶原酶E 进行酶消化，并结合基于二氧化硅的密度梯度分离介质，从小鼠结肠组织中分离固有层单个核细胞的方法。所分离的单个核细胞可用于后续的下游分析。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 溶液的配制

1. 如表1所述，配制结肠缓冲液、100%二氧化硅密度分离介质、66%二氧化硅密度分离介质、44%二氧化硅密度分离介质、胶原酶E消化缓冲液以及FACS缓冲液。
   1. 在实验前一天配制结肠缓冲液，并于4 °C过夜保存。
   2. 在实验前一天配制100%二氧化硅密度分离介质，并于4 °C过夜保存；实验当天早晨将其置于室温下解冻。
   3. 在细胞分离当天早晨，使用室温的100%二氧化硅密度分离介质和结肠缓冲液配制66%和44%二氧化硅分离介质。
   4. 测量适量来源于 Clostridium histolyticum的胶原酶E，并在实验前夜于-20 °C保存。次日早晨，将其溶解于适当体积的结肠缓冲液中，制成胶原酶消化缓冲液。实验当天所有使用胶原酶消化缓冲液的孵育步骤，均需预先将溶液升温至37 °C。
2. 在整个实验流程中，设置一台离心机保持20 °C、转速859 x g、关闭刹车（0级减速），用于梯度离心；另设一台离心机保持4 °C、转速859 x g、标准减速，用于洗涤步骤。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
60 mm 培养皿	Thermo Scientific	150288
1x PBS	Corning	21-040-CV
10x PBS	Lonza BioWhittaker	BW17-517Q
10 mL 一次性血清移液管	Corning	4100
10 mL 注射器	Becton Dickinson	302995
15 mL 非无菌锥形管	TruLine	TR2002
18 G 钝头针	Becton Dickinson	305180
25 mL 一次性血清移液管	Corning	4250
40 μm 孔径细胞筛	Corning	352340
50 mL Falcon 管	Corning	21008-951
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A4503-1KG
固定缓冲液	Biolegend	420801
来自溶组织梭菌的 E. coli 胶原酶 E	Sigma	C2139
EDTA，0.5 M 无菌溶液	Amresco	E177-500ML
胎牛血清	Thermo /Fisher Scientific -HyCLone	SV30014.03
HEPES	GE Healthcare-HyClone	SH30237.01
Percoll	GE Healthcare-Life Sciences	1708901
RPMI 培养基	Corning	17-105-CV
叠氮化钠	VWR Life Science Amresco	97064-646
台盼蓝	Lonza BioWhittaker	17-942E