胃底腺体分离：一种从人胃组织中分离胃底腺体的方法

摘要

来源：Teal, E. 等. 用于研究再生的鼠源和人源原代胃上皮单层培养。J. Vis. Exp. (2018)

本视频介绍了一种从人胃底组织中分离胃上皮细胞的方法。所分离的上皮细胞可作为体外模型，用于研究其在胃生理学和病理生理学中的调控作用。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 建立人源三维胃底类器官

注意：为避免污染，整个实验步骤均需在无菌细胞培养罩内进行。人胃底组织来自接受袖状胃切除术的患者。

1. 从接受袖状胃切除术的患者中采集组织，置于冰上预冷的含钙溶液中²⁺/毫克²⁺无钙镁杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）置于大型塑料容器中。
2. 使用镊子在含有 100 mL Ca 的无菌烧杯中剧烈清洗组织²⁺/毫克²⁺无钙镁DPBS洗涤约30秒，或直至去除碎片和血液。随后，使用无菌纱布轻轻擦去上皮表面的黏液层。
3. 使用大号镊子牢固夹住组织的肌层，并用大号弯止血钳用力刮除上皮层。将刮下的上皮碎片收集至无菌的聚苯乙烯培养皿中。
4. 将上皮组织切成约 2.0 x 2.0 mm 的小块² 使用剃刀将组织切成大小均匀的片段，以优化组织消化效果。用含钙离子的溶液洗涤组织片段²⁺/毫克²⁺ 无DBPS培养基，添加抗生素（Ca²⁺/毫克²⁺ 无钙镁DPBS，1%青霉素/链霉素，0.25 mg/mL两性霉素B /10 mg/mL庆大霉素，50 mg/mL卡那霉素），直至洗涤液中无血液残留。必要时可进行多次洗涤。通过无菌纱布将洗涤液过滤至废液杯中，小心弃去洗涤液。
5. 将洗涤后的组织碎片收集至一个125 mL玻璃圆底烧瓶中，加入25 mm搅拌子和预热的培养基（基础培养基中添加2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素、10 mM HEPES缓冲液、1 mg/mL I型胶原酶、2 mg/mL细胞培养级牛血清白蛋白）。用橡胶隔垫密封圆底烧瓶。
6. 将20G脊髓穿刺针插入隔膜中，并使用橡胶管连接至氧气瓶。为过滤可能存在的污染物，在管路中插入纱布以形成过滤层。开启氧气低流量输出。在隔膜中插入10–15根出气针，以防止隔膜破裂。
7. 使用夹子将装置固定在铁架台上，置于已校准至 37 °C 的水浴中，并配备搅拌装置，孵育 30–45 分钟。组织孵育 15 分钟后，取出 50 µL 孵育液，肉眼观察是否有腺体解离。若腺体密度不足或未从组织中分离，继续孵育额外 5–10 分钟。
8. 孵育结束后，立即使用无菌移液管或直接倾倒的方式，向孵育体系中加入50 mL预热的DMEM/F-12培养基。
9. 将腺体混合物通过无菌纱布过滤至四个50 mL锥形管中。将滤液置于冰上15分钟，使提取的腺体沉降至锥形管底部。注意不要扰动已沉降的腺体，用移液管小心吸除并弃去上层40 mL上清液。将剩余的10 mL重悬于10 mL含抗生素的DPBS中。
10. 将混合物均匀分装至5 mL细胞培养试管中。在65 × g条件下离心5分钟。 g 在 4 °C 下离心，然后使用移液器小心移除上清液。
    注意： 此步骤必须在冰上操作，并在混合过程中避免基底膜基质发生聚合。此外，需取50 µL样品进行肉眼观察腺体密度，最佳密度约为70%融合度。
11. 接下来，使用宽口移液器将腺体接种于50 µL基底膜基质中。接种过程中避免产生气泡。
12. 为使基底膜基质聚合，在37 °C下孵育10至15分钟。若在12孔培养板中接种，每孔加入1 mL hFGO培养基（含2 mM L-谷氨酰胺、1% 青霉素/链霉素、0.25 mg/mL 两性霉素B /10 mg/mL 庆大霉素、50 mg/mL 卡那霉素、10 mM HEPES缓冲液、1 mM N-乙酰半胱氨酸、1× N2、1× B27、50% Wnt条件培养基、20% R-spondin条件培养基并补充100 ng/mL骨形态发生蛋白抑制剂、1 nM胃泌素、50 ng/mL表皮生长因子、200 ng/mL成纤维细胞生长因子10、10 mM烟酰胺和10 µM Y-27632 ROCK抑制剂的Advanced Dulbecco's改良Eagle培养基/F-12培养基）。若未使用12孔培养板，则加入足量培养基以完全浸没基底膜基质液滴。
13. 在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞₂ 湿润的细胞培养孵育箱。每4-5天更换一次培养基。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无 Ca2+/Mg2+ 的 DPBS	Fisher	21-031CV
无菌纱布
弯止血钳
无菌培养皿
无菌剃刀刀片
高级杜尔贝科改良伊格尔/ F12 培养基（基础培养基）	Life Technologies	12634-010
青霉素/链霉素	Thermo Scientific	SV30010
两性霉素 B/庆大霉素	Thermo Scientific	R01510
GlutaMAX（L-谷氨酰胺）	Life Technologies	25030-081
卡那霉素	Thermo Fisher	RO1510
Ⅰ型胶原酶	Worthington	LS004214
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	A9418
HEPES 缓冲液	Sigma Aldrich	H0887
125 mL 圆底烧瓶
1 英寸（25 mm）搅拌子
橡胶隔垫
长度为 3.5 英寸的 20G 脊髓穿刺针	Thermo Fisher	405182
Kimwipes（纸巾）	Fischer Scientific	06-666C
带橡胶软管的氧气瓶
铁架台夹具
37 °C 水浴锅
5 mL 细胞培养试管	Fisher	14-956-3C