小肠隐窝分离：一种从小鼠模型小肠中分离完整隐窝的方法

摘要

来源：Schewe, M. 等. 用于肠道干细胞与微环境细胞功能分析的类器官重建实验（ORA）。J. Vis. Exp. (2017)

在本视频中，我们演示了一种从小鼠小肠中分离完整隐窝的技术。分离得到的完整隐窝可用于在体外培养长期存活且具有自我更新能力的三维类器官。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 仪器、培养基和培养皿的准备

1. 将一套肠剪、普通剪刀和镊子放入无菌容器中进行高压灭菌。
2. 将一个96孔（平底）培养板置于37 °C 培养箱中。
3. 根据材料表中列出的试剂，配制10 mL完全培养基。
4. 将完全培养基置于37 °C水浴中孵育。
5. 将重构的基底膜置于冰桶中解冻。重构的基底膜在4 °C时会变为液态。
6. 用冷的磷酸盐缓冲液（PBS，4 °C）填充四个培养皿。

2. 小肠隐窝的分离

1. 以一氧化碳处死₂ 吸入麻醉 Lgr5-eGFP-IRES-CreER^t2 C57BL/6J 背景的小鼠。用剪刀纵向解剖腹膜。
2. 用镊子夹住胃部，并横向将其剪成两半。
3. 从现在开始使用肠剪，将肠道取出并置于含有 PBS 的培养皿中。
   注意： 肠道剪具有锋利端和钝端。其钝端设计旨在打开肠道时避免损伤隐窝-绒毛结构。
4. 首先将钝头插入胃部，并轻轻穿过幽门。然后用剪刀进行剪切，同时用镊子牵拉。
5. 将整个小肠纵向打开后，用镊子夹住组织，在冷的PBS中以U形动作轻轻冲洗。
6. 待所有粪便残渣清除后，将肠管置于砧板上展平，管腔面朝上。管腔面无血管分布，颜色较外侧更苍白，易于识别。
7. 用载玻片轻轻刮取压平的肠组织，以去除绒毛。沿组织全长重复此步骤两次。
8. 使用无菌手术刀将小肠切成 2–5 mm 的小段。
9. 将小肠组织碎片置于含有10 mL预冷PBS的50 mL离心管中。
10. 用移液管在磷酸盐缓冲液（PBS）中反复吹打组织碎片以清洗，去除残留杂质。弃去上清液，重复此步骤直至PBS完全澄清。
11. 加入15 mL冷的PBS，使PBS的终体积达到25 mL。加入2 mM乙二胺四乙酸（EDTA），在4 °C下于滚转仪上孵育45 min。
12. 弃去 PBS/EDTA。
13. 加入10 mL PBS，通过剧烈吹打组织碎片（至少三次）使隐窝脱落。收集上清液。
14. 重复 步骤 2.13 四次。加入培养基至终体积为50 mL。
15. 通过离心沉淀细胞（300 x g） g 5分钟。
16. 将沉淀重悬于10 mL培养基中，通过离心（80 × g）沉淀隐窝 g 3 分钟。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高级DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634-010
青霉素/链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140122	终浓度：1%
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061	终浓度：10 mM
Hepes	Thermo Fisher Scientific	15630080	终浓度：10 mM
重组小鼠EGF	Thermo Fisher Scientific	PMG8041	终浓度：50 ng/ml
重组小鼠Noggin	Peprotech	250-38	终浓度：100 ng/ml
y27632	Sigma	Y0503	终浓度：10 µM
Jagged-1	Anaspec Bio	AS-61298	终浓度：1 µM
重组小鼠R-spondin	R&D systems	3474-RS-050	终浓度：1 mg/ml
B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J	Jackson Laboratories	8875
低吸附离心管	Eppendorf	Z666548-250EA