肠隐窝分离:一种从小鼠模型小肠中分离整个隐窝的方法

摘要

来源:Schewe， M. et al.用于肠道干细胞和生态位细胞功能分析的类器官重组测定 （ORA）。J. Vis. Exp.（2017 年）

在本视频中，我们演示了一种从小鼠的小肠中分离整个隐窝的技术。分离的整个隐窝可用于在体外繁殖长寿命和自我更新的 3D 类器官。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 乐器、培养基和餐具的准备

在
1. 无菌容器中高压灭菌一套肠道剪刀、普通剪刀和镊子。
2. 将 96 孔（平底）培养皿置于 37 °C 的培养箱中。
3. 使用材料表中列出的试剂制备 10 mL 完全培养基。
4. 将完全培养基在 37 °C 的水浴中孵育。
5. 将重构的基底膜放入冰桶中解冻。重构的基底膜在 4 °C 时将变为液态。
6. 用冷磷酸盐缓冲盐水或 PBS （4 °C） 填充四个培养皿。

2. 小肠隐窝的分离

1. 通过在 C57BL6/J 背景上吸入 CO₂ 吸入 Lgr5-eGFP-IRES-CreER^t2 小鼠来处死。用剪刀纵向解剖腹膜。
2. 用镊子夹住胃，横向切成两半。
3. 从现在开始，使用肠道剪刀，将肠道拉出并放入含有PBS的培养皿中
   注意:肠道剪刀的尖端锋利而钝。这些剪刀的钝尖是为了在打开肠道时不会损坏隐窝绒毛结构。
4. 首先将钝头放入胃中，然后轻轻地将其推入幽门。用剪刀剪断并用镊子拉动。
5. 纵向打开整个小肠后，用镊子握住它在冷的 PBS 中洗涤，然后以 U 形动作在 PBS 溶液中轻轻冲洗。
6. 清除所有粪便残留物后，继续在砧板上将肠道压平，管腔面朝上。由于没有血管，与外部相比，其苍白的外观很容易识别。
7. 用载玻片刮擦扁平的肠子，轻轻去除绒毛。沿组织的整个长度执行此步骤两次。
8. 用无菌手术刀片将小肠切成 2-5 毫米的小块。
9. 将小肠片段放入含有 10 mL 冰冷 PBS 的 50 mL 试管中。
10. 清洁组织碎片，通过在 PBS 中上下移液去除任何残留的杂质。弃去上清液并重复此步骤，直到 PBS 完全澄清。
11. 加入 15 mL 冷 PBS，使 PBS 的最终总体积达到 25 mL。加入 2 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA），并在 4 °C 下在滚筒上孵育 45 分钟。
12. 丢弃 PBS/EDTA。
13. 加入 10 mL 的 PBS，并通过上下用力吹打组织碎片（至少三次）来分离隐窝。收集上清液。
14. 重复步骤 2.13 四次。添加培养基以达到 50 mL 的最终体积。
15. 通过离心（300 x g 5 分钟）沉淀细胞。
将
16. 沉淀重悬于 10 mL 培养基中，并通过离心（80 x g ，3 分钟）沉淀隐窝。

材料