从鸡胚尿囊膜中分离转移性癌细胞克隆：一种从无壳鸡蛋培养物中分离癌细胞的方法

摘要

来源：Stoletov, K. 等. 利用快速定量的鸡胚尿囊绒毛膜活体模型发现转移调控因子. J. Vis. Exp. (2021)

在本视频中，我们描述了利用无壳蛋培养技术从鸡绒毛尿囊膜（CAM）中分离转移性癌细胞集落的方法. 该方法有助于筛选可能介导癌症转移的因素。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 转移性克隆的分离

1. 注射后第5天，从培养箱中取出胚胎，检查胚胎绒毛尿囊膜（CAM）上的转移性克隆分布情况。筛选出克隆分布均匀、且存在致密（或过度侵袭性）克隆的胚胎。
   注意： 鸡胚培养过程并非无菌操作，因此所有筛选步骤必须在高度洁净的条件下进行，以避免后续组织培养污染。污染较为罕见，通过佩戴手套和口罩，并在细胞注射及克隆分离过程中仅使用无菌工具，即可轻松避免。建议逐个检查胚胎，以减少其暴露于实验室环境温度的时间，并防止污染。
2. 定位感兴趣的转移性克隆。致密克隆可描述为大多数癌细胞局限于CAM组织内某一有限区域（细胞呈现“聚集”状态）；侵袭性克隆则表现为癌细胞在CAM组织中“弥散”分布（图1A, B）。
   注意： 转移性克隆的“致密性”可能源于癌细胞侵袭能力受抑制、癌细胞增殖受抑制，或两者兼有。应关注所有可能情况，并分离接触性克隆（图1A, B）。可使用简单的荧光体视显微镜区分致密型与侵袭型转移克隆表型。
3. 在解剖显微镜下，使用精细镊子轻轻向上提起含有目标转移性克隆的CAM组织（图1C）。
....

结果

图1. 筛选实验不同步骤的代表性结果。（A）异质性（文库转导的癌细胞系HEp3细胞）注射后5天形成的转移性克隆。红色箭头指示致密克隆（潜在阳性信号），应予以切除。（B）其中一个筛选阳性克隆（KIF3B）再次注射后5天形成的转移性克隆。插图显示从虚线方框中数字裁剪出的转移性克隆图像。此图像质量适用于C.I.定量分析。图中显示了该阳性克隆（KIF3B）再注射后的平均C.I.值。（C）从CAM组织中分离感兴趣的转移性克隆。（D）对照克隆和（E

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 锥形离心管。	Corning	CLS430791-500EA
18 号 × 1 1/2 英寸 BD Precision<br/> 针头	BD	BD305196	我们使用 1.2 mm × 40 mm 的针头，也可<br/> 根据需要选用更短的针头
台式离心机。	多个供应商可提供		任何适用于细胞离心的 TC 兼容离心机<br/> 均可使用，且均适用<br/>
胶原酶	Sigma	C0130-100MG
棉签	多个供应商可提供		使用前必须灭菌
适用于所用细胞<br/> 系的培养基	多个供应商可提供		我们使用 DMEM 加 10% FBS 培养基培养 HT1080、HEp3 和 b16 细胞<br/> 系
孵蛋器	多个供应商可提供		所需的具体型号取决于筛选规模<br/> 。可选供应商包括位于佐治亚州萨凡纳的 MGF Company<br/> Inc.，以及位于加利福尼亚州丘拉维斯塔的 Lyon Electric<br/> Company Inc.<br/>
Eppendorf 管，1.5 ml	Sigma	T4816-250EA
受精的白来航鸡蛋	任何本地供应商
精细镊子	多个供应商可提供		使用前必须灭菌
图像分析软件			我们使用 Nikon Elements
PBS (1x)	多个供应商可提供
塑料称量皿	Simport	CA11006-614	尺寸为 78×78×25 mm；也可<br/> 选用其他多种来源
小型手术剪刀	多个供应商可提供		使用前必须灭菌
体视荧光显微镜			我们使用 Zeiss Lumar v12