来源：Prasad, M. 等. 利用腺相关病毒-Cas9系统体外建立基因工程改造的小鼠头颈部癌细胞系. J. Vis. Exp. (2020)
在本视频中，我们介绍了从小鼠舌头中分离上皮细胞的方法。这些细胞可进一步培养以形成细胞克隆。
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方法文章
小鼠舌上皮细胞的分离与培养：一种从小鼠模型中分离和培养舌上皮细胞的操作方法
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2023年4月30日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 原代细胞的分离与培养
- 使用二氧化碳窒息法或其他经IACUC批准的方案，处死一只6周龄的雄性或雌性B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J小鼠。
注意： 这些CRISPR/Cas9基因敲入小鼠在CAG启动子驱动下，依赖Cre重组酶表达cas9内切酶和EGFP。这些小鼠基因组中上游存在的Lox-Stop-Lox（LSL）序列可在无Cre重组酶时阻止Cas9和EGFP的表达。当与单导向RNA（sgRNA）及Cre来源共同使用时，可在体内或体外实现对单个或多个小鼠基因的编辑。 - 使用手术剪从小鼠尸体中解剖出舌组织。
- 使用解剖刀将舌组织切成极小的碎片，手动解离组织。将组织碎片收集至含有4.5 mL无血清RPMI基础培养基的15 mL离心管中。
- 向组织碎片中加入三酶混合液（200 µL）（配方见表1）。
- 将组织与酶混合物在37 °C孵育30分钟，每隔10分钟轻弹管壁，以促进酶解组织的解离。
- 向组织-酶混合物中加入含5%胎牛血清（FBS）的HBSS/PBS，以终止酶反应。
- ....
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 小鼠品系 | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAGcas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| 酶 | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNase | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
| 胰蛋白酶 | Biological Industries Israel BeitHaemek Ltd. | 03-050-1B | |
| 培养基、化学试剂与试剂 | |||
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DMEM | Biological Industries Israel BeitHaemek Ltd. | 01-055-1A | |
| FBS | Biological Industries Israel BeitHaemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| PBS | Biological Industries Israel BeitHaemek Ltd. | 02-023-1A | |
| Tris 缓冲液 | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| 塑料器皿 | |||
| Amicon-ULTRA 滤膜（100 KDa） | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 µm 无菌滤器，4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 µm 无菌滤器，13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| 培养板 | Greiner Bio-One | ||
| Falcon 管 | Greiner Bio-One |
