福尔马林固定石蜡包埋组织RNA显色原位杂交前处理：一种用于RNA显色原位杂交的福尔马林固定石蜡包埋组织切片处理流程 关键词：FFPE组织，RNA显色原位杂交，福尔马林固定，石蜡包埋，组织前处理，原位杂交，RNA检测，组织切片

摘要

来源：Outh-Gauer, S. 等. 染色原位杂交作为人乳头瘤病毒相关头颈部癌症诊断的工具. J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本进行RNA染色原位杂交前处理的步骤。前处理过程有助于保持细胞内核酸的完整性以及整体组织形态。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 材料的准备

1. 1× 目标修复试剂的配制
   1. 在一大烧杯中，将 70 mL 的 10× 目标修复试剂 （见 材料表） 加入 630 mL 蒸馏水中。
   2. 将烧杯置于带磁力搅拌器的加热板上，并用铝箔覆盖。
   3. 在 100 °C 下煮沸 10–15 分钟。
      注意：煮沸时间不得超过 30 分钟。

2. 组织预处理

注意：这些步骤遵循制造商针对头颈部样本提出的“标准”预处理建议。根据所操作的组织类型，第 2.1 和 2.2 节的操作时间可能需要相应调整。

1. 阻断过氧化物酶活性
   1. 向每张载玻片上加入 4–6 滴过氧化氢 （参见 材料表），室温孵育 10 分钟。
   2. 用蒸馏水在室温下洗涤载玻片，每次 2 分钟，共洗 2 次。
2. 断裂 RNA/组织结合
   1. 用镊子移除置于加热板上、正在沸腾的 1× 目标修复试剂（TTR1x）容器表面的铝箔，并停止搅拌。将载玻片架缓慢且极其小心地浸入其中，持续 15 分钟。之后再次用铝箔覆盖烧杯。
      注意：此步骤期间必须保持微沸状态。
      警告：使用镊子操作铝箔和载玻片架，以避免烫伤。务必穿戴适当的个人防护装备，如手套和实验服。
   2. 立即用镊子将热的载玻片架迅速转移至蒸馏水浴中，洗涤 2 分钟。
      注意：确保样本不在 TTR1x 中冷却。
   3. 用新鲜的 100% 乙醇洗涤载玻片 2 分钟。
   4. 让载玻片在室温下干燥 2 分钟。
3. 建立疏水屏障
   1. 使用疏水屏障笔 （参见 材料表），在样本周围画一圈屏障。使其干燥至少 5 分钟。
      注意：确保屏障完全干燥。若在操作过程中屏障磨损，请毫不犹豫地重新绘制。避免用笔触碰组织。本步骤可在此处暂停过夜。
4. 蛋白酶消化
   1. 将载玻片放置在载玻片架上，每个样本加入约 4 滴 Protease Plus （参见 材料表）。
   2. 将湿度控制盘盖上盖子，放入杂交炉中，在 40 °C 下孵育 30 分钟。
      注意：为防止蒸发，请确保旋钮完全旋转至锁定位置。
   3. 从烘箱中取出托盘，并取出载玻片架。
   4. 逐张载玻片快速去除多余液体，并将其放入盛有蒸馏水的染色缸中浸没的载玻片架内。
   5. 用蒸馏水在室温下洗涤载玻片，每次 2 分钟，共洗 2 次。持续轻轻振荡。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HybEZ 烤箱（110v）	Advanced Cell Diagnostics 公司	321710
HybEZ 载玻片架	Advanced Cell Diagnostics 公司	300104
ImmEdge 疏水屏障笔	Advanced Cell Diagnostics 公司	310018
RNAscope H202 &蛋白酶增强试剂	Advanced Cell Diagnostics 公司	322330	过氧化氢 ×2 和蛋白酶 Plus ×1
RNAscope 目标修复试剂	Advanced Cell Diagnostics 公司	322000