RNA原位杂交中的探针杂交与信号放大：组织切片中特异性RNA序列检测技术

摘要

来源：Outh-Gauer, S. 等. 染色原位杂交作为人乳头瘤病毒相关头颈部癌症诊断的工具. J. Vis. Exp. (2019)

本视频介绍了一种顺序杂交策略，该策略通过将mRNA探针与特定靶标mRNA进行杂交来实现检测。在探针杂交完成后，进行信号放大，以降低组织学样本RNA-CISH过程中的信噪比，从而提高分辨率。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 实验检测的运行

注意：孵育步骤之间切勿让切片干燥。

1. HPV 探针的杂交
   注意：使用前请确保探针已预热，以溶解可能存在的沉淀。在此步骤中，可使用肽基脯氨酰异构酶 B（PPIB）作为阳性对照，或使用二氢去氢二氨基庚二酸还原酶（DAPB）作为阴性对照，代替 HPV 探针（参见材料表）。
   1. 轻敲或轻弹载玻片以去除多余液体，并将载玻片放入载玻片架中。每张切片上加入约 4 滴 HPV 探针，确保完全覆盖组织区域。
   2. 用盖子盖好染色缸，并将其放入 40 °C 的烘箱中孵育 2 小时。
      注意：为防止蒸发，请确保旋钮完全旋转至锁定位置。
   3. 从烘箱中取出染色缸，并取出载玻片架。
   4. 逐张快速去除载玻片上的多余液体，并将其放入盛有 1× 洗涤缓冲液的染色皿中，使载玻片架完全浸没。
   5. 在室温下以持续振荡方式用 1× 洗涤缓冲液洗涤载玻片 2 分钟。更换新的 1× 洗涤缓冲液后重复一次。
2. AMP1、AMP2、AMP3 和 AMP4 的杂交
   注意：这些步骤包括在杂交炉中进行的杂交反应，以及来自购买试剂盒的 AMP1–AMP4 （参见材料表）。
   1. 轻敲或轻弹载玻片以去除多余液体，并将载玻片放入载玻片架中。每张切片上加入约 4 滴 AMP1，确保完全覆盖组织区域。
   2. 用盖子盖好染色缸，并将其放入 40 °C 的烘箱中孵育 30 分钟。
   3. 从烘箱中取出染色缸，并取出载玻片架。
   4. 逐张快速去除载玻片上的多余液体，并将其放入盛有 1× 洗涤缓冲液的染色皿中，使载玻片架完全浸没。
   5. 在室温下以持续振荡方式用 1× 洗涤缓冲液洗涤载玻片 2 分钟。更换新的 1× 洗涤缓冲液后重复一次。
   6. 重复步骤 1.2.1–1.2.5，但使用约 4 滴 AMP2 代替 AMP1，并在 15 分钟 内于 40 °C 下孵育。 使用新鲜洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次 2 分钟。
   7. 重复步骤 1.2.1–1.2.5，但使用约 4 滴 AMP3 代替 AMP1，并在 30 分钟 内于 40 °C 下孵育。 使用新鲜洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次 2 分钟。
   8. 重复步骤 1.2.1–1.2.5，但使用约 4 滴 AMP4 代替 AMP1，并在 15 分钟 内于 40 °C 下孵育。 使用新鲜洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次 2 分钟。
3. AMP5 和 AMP6 的杂交
   ​注意：这些步骤不包括在烘箱中的杂交，而是在室温下进行杂交。AMP5 和 AMP6 来自购买的试剂盒（参见 材料表）。
   1. 轻敲或轻弹载玻片以去除多余液体，并将载玻片放入载玻片架中。每张切片上加入约 4 滴 AMP5 ，确保完全覆盖组织区域。
   2. 用盖子盖好染色缸，并在 30 分钟 内于 室温下孵育。
   3. 逐张快速去除载玻片上的多余液体，并将其放入盛有 1× 洗涤缓冲液的染色皿中，使载玻片架完全浸没。
   4. 在室温下以持续振荡方式用 1× 洗涤缓冲液洗涤载玻片 2 分钟。更换新的 1× 洗涤缓冲液后重复一次。
   5. 重复步骤 1.3.1–1.3.4，但使用约 4 滴 AMP6 代替 AMP5，并在 15 分钟 内于 室温下孵育。 使用新鲜洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次 2 分钟。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HybEZ 烤箱 (110v)	Advanced Cell Diagnostics Inc.	321710
HybEZ 载玻片架	Advanced Cell Diagnostics Inc.	300104
RNAscope 2.5 HD 检测试剂 - 棕色	Advanced Cell Diagnostics Inc.	322310	该试剂盒包含扩增试剂 AMP1、AMP2、AMP3、AMP4、AMP5 和 AMP6，以及检测试剂 DAB-A 和 DAB-B
RNAscope 3-plex 阴性对照探针	Advanced Cell Diagnostics Inc.	320871	DAPB
RNAscope 3-plex 阳性对照探针	Advanced Cell Diagnostics Inc.	320861	PPIB
RNAscope 探针 - HPV16/18	Advanced Cell Diagnostics Inc.	311121
RNAscope 洗涤缓冲液试剂	Advanced Cell Diagnostics Inc.	310091	洗涤缓冲液 50X ×4