RNA CISH信号检测：在完整组织标本中进行RNA原位杂交时检测显色信号的技术

摘要

来源：Outh-Gauer, S. 等. 染色原位杂交技术作为人乳头瘤病毒相关头颈部癌症诊断的工具。J. Vis. Exp. (2019)

本视频介绍了RNA显色原位杂交过程中信号检测的实验方案。该技术可用于在完整组织样本中直观诊断是否存在活跃的致癌感染。

方案

1. 复染试剂的制备

1. 配制50%苏木精染液。
   1. 在通风橱中，将100 mL Gill苏木精I液 （参见 材料表） 加入到染色缸中的100 mL蒸馏水中。
      注意： 50%苏木精染色液可重复使用，最长不超过1周。
2. 配制0.02%（w/v）氨水（蓝化试剂）。
3. 在通风橱中，将1.43 mL 1 N氢氧化铵加入盛有250 mL蒸馏水的量筒或其他容器中。用石蜡膜密封量筒，充分混匀3至5次。
   注意： 为确保检测定量的准确性，必须使用氢氧化铵。试剂可预先配制，但需确保所有容器始终保持密闭状态。

2. 使用3,3'-二氨基联苯胺进行信号检测

注意：二氨基联苯胺（DAB）具有毒性。处理和弃置该化学品时，应遵循适当的安全预防措施和操作规范。

1. 取适当大小的离心管，将等体积的DAB-A和DAB-B（见 材料表）通过滴加相同滴数的两种溶液混合。每张切片配制约120 µL DAB底物（每种试剂约2滴，共4滴），充分混匀3至5次。
2. 从切片架中一次取出一张载玻片，轻敲或弹动以去除多余液体，再将其放回切片架中。
3. 向每张组织切片上滴加约120 μL DAB溶液，确保完全覆盖组织，室温孵育10分钟。
4. 根据当地规定处理剩余的DAB溶液，并将载玻片放入盛有自来水的染色缸中浸没的切片架内。

3. 复染

1. 将染色架移至含有50%苏木精染色液的染色缸中，在室温下静置30秒。注意，此时切片会变为紫色。
2. 立即将染色架转移回盛有自来水的染色缸中，通过上下移动染色架清洗切片3–5次。
3. 使用新鲜自来水重复清洗步骤，直至切片背景清晰，而组织部分仍保持紫色。
4. 将染色缸中的自来水更换为0.02%氨水，上下移动染色架2–3次。注意，组织切片应变为蓝色。
5. 将氨水替换为自来水，清洗切片3–5次。

4. 脱水

1. 将载玻片架移至通风橱内盛有70%乙醇的染色缸中，偶尔晃动，静置2分钟。
2. 将载玻片架移至盛有100%乙醇的第一染色缸中，偶尔晃动，静置2分钟。
3. 将载玻片架移至盛有100%乙醇的第二染色缸中，偶尔晃动，静置2分钟。
4. 将载玻片架移至盛有二甲苯的染色缸中，偶尔晃动，静置5分钟。

5. 载玻片封片

1. 从载物架上取下载玻片，平放于通风橱中，组织切片面朝上。
2. 逐张封片：每张载玻片上加入一滴以二甲苯为基质的封片介质，小心地将 24 mm × 50 mm 的盖玻片覆盖在组织切片上，避免产生气泡。
3. 室温下静置干燥 ≥5 分钟。

6. 样品评估

1. 在标准明场显微镜下以20x–40x的放大倍数观察组织切片。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
苏木精溶液，Gill 1号	Merck	GHS132
RNAscope 2.5 HD 检测试剂-棕色	Advanced Cell Diagnostics Inc.	322310	该试剂盒包含扩增试剂 AMP1、AMP2、AMP3、AMP4、AMP5 和 AMP6，以及检测试剂 DAB-A 和 DAB-B
RNAscope 探针- HPV16/18	Advanced Cell Diagnostics Inc.	311121
HybEZ 载玻片架	Advanced Cell Diagnostics Inc.	300104
ImmEdge 疏水屏障笔	Advanced Cell Diagnostics Inc.	310018