从大鼠脊柱中采集背根神经节：一种从大鼠模型脊柱中提取背根神经节的操作流程

摘要

来源：Schmidt, L. B. 等. 利用鸡胚尿囊绒毛膜体内模型评估头颈部癌症中的神经周围浸润。J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们演示如何从获取的大鼠脊柱中分离背根神经节（DRG），用于后续实验应用。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 背根神经节的收获与制备（预计耗时：2 小时，第 8 天）

注意：涉及小鼠和大鼠的实验需获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。在一些国家，使用鸡胚也需获得批准。

1. 取六至七周龄的 Sprague Dawley 大鼠（体重约 200 g）以分离背根神经节（DRG）。
   注意：一只大鼠通常可获得约 40 个颈段和胸段 DRG。小鼠 DRG 也可整合入 CAM，但该物种的实验条件需单独优化。
2. 在超净工作台内，按照已发表的小鼠 DRG 分离方案，从大鼠颈段和胸段区域获取 DRG。参考 图 1 以确定 DRG 分离的操作方向。
   1. 腹腔注射 Ketamine/Xylazine 后，通过心脏穿刺处死大鼠。用 70% 乙醇清洁大鼠皮肤，并使用剪刀取出脊柱。避免采用颈椎脱臼法处死，以免损伤颈段 DRG。
   2. 使用同一把剪刀，根据 图 1A-D 提供的解剖示意图和大体图像，将颈椎、胸椎和腰椎区域分开。将脊柱各段置于盛有 1× PBS 的 10 cm 培养皿中，以保持组织湿润。
   3. 使用精细骨剪，从背侧和腹侧打开椎骨，将脊柱分为左右两个半侧（图 1E-F）。将组织片段转移至盛有新鲜 1× PBS 的洁净 10 cm 培养皿中。
   4. 用镊子轻轻将脊髓从椎骨上分离，以暴露背根神经节 DRG（图 1G）。
   5. 将精细镊子置于每个 DRG 下方，夹住并将其从骨性凹槽中轻轻拉出。切勿直接夹持 DRG，以免造成组织损伤。不要修剪 DRG 上附着的轴突束（图 1H）。
      注意：避免使用腰段 DRG，因其在 CAM 中的整合能力较弱。关于 DRG 区域定位，请参考 图 1A-D 中的示意图和大体解剖图像。
3. 分离后立即把每个 DRG 置于添加了 2% 青霉素/链霉素（Pen/Strep）和 10% 热灭活胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基中，以帮助防止 DRG 发生细菌污染。将所有 DRG 集中放入同一个 6 cm 培养皿中，加入 4 mL 培养基。
4. 在完成所有 DRG 的分离后，将其转移至新的培养皿中，培养基为含 2% Pen/Strep 和 10% FBS 的 DMEM，并加入 1.25 µg/mL 红色荧光染料。在细胞培养箱中孵育 1 小时。

结果

图1： 第8天背根神经节（DRG）的提取。A. 大鼠示意图，显示脊柱的解剖位置。B. 大鼠椎骨排列示意图，展示不同身体区域；绿色代表颈椎，深蓝色代表胸椎，橙色代表腰椎，浅蓝色代表骶椎。C-D. 手术切除后大鼠脊柱的腹侧面；各区域划分如B所示。E. 解剖椎骨以打开脊髓管，将椎体分为两个侧部，每侧包含背根神经节（DRG）；切口应沿每块椎骨的背侧和腹侧中线进行。F. 打开后的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PBS (1x) pH 7.4	Gibco	# 10010-023	磷酸盐缓冲液
Sprague Dawley 大鼠（雌性）	Charles River 实验室	品系编号：001	6-7 周龄（体重 190-210 g）
Dumont #5 精细镊	精细科学工具（FST）	# 11254-20	用于取材背根神经节（DRG）
超精细 Graefe 镊，弯型	精细科学工具（FST）	# 11151-10	用于第 8 天将 DRG 移植至 CAM 以及第 17 天取材 CAM 组织
超精细 Graefe 镊，直型	精细科学工具（FST）	# 11150-10	用于第 8 天将 DRG 移植至 CAM 以及第 17 天取材 CAM 组织
DMEM (1x)	Gibco	# 11965-092	杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）
CellTracker Red CMTPX 荧光染料	Life Technologies	# C34552	将 50µg 溶于 40µL DMSO 中重悬，-20°C 保存。每毫升培养液中加入 1µL 储存液
青霉素/链霉素（Pen/Strep）	Gibco	# 15140-122	10,000 单位/mL 青霉素，10,000 µg/mL 链霉素
HI FBS	Gibco	# 10082-147	热灭活胎牛血清
DMSO	Fisher Bioreagents	# BP231-100	二甲基亚砜