鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）肿瘤模型：一种模拟肿瘤细胞神经周围浸润的鸡胚内实验方法

摘要

来源：Schmidt, L. B. 等. 利用鸡胚尿囊绒毛膜体内模型评估头颈部癌症中的神经周围侵袭。J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们介绍了将背根神经节与癌细胞共同培养于鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）上以研究神经周围浸润的方法。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 在 CAM 上移植 DRG（预计耗时：40 分钟，第 8 天）

1. 准备一个含有HBSS培养基的6 cm培养皿，用于在植入前清洗DRG。将准备好的鸡蛋移至细胞培养超净台中。去除鸡蛋上的石蜡膜（图1A）。
2. 用无菌精细镊子轻轻夹取培养基内的一颗DRG。将其浸入HBSS培养基中，以去除含有荧光染料的多余培养基。操作时需非常轻柔地夹持DRG，否则其会黏附在镊子上。
3. 将DRG放置于CAM上，注意不要刺破膜结构（图1B-C）。必要时可使用另一把镊子辅助，帮助在放置时使DRG从镊子尖端脱离。
   注意：保持DRG被HBSS培养基润湿也有助于其从镊子上顺利脱离。
4. 用无菌透明薄膜敷料覆盖鸡蛋，将蛋壳上所有开窗和穿刺部位完全覆盖，以避免细菌污染（图1D）。
5. 完成所有鸡蛋的DRG移植后，将鸡蛋置于38 °C、54%湿度的加湿培养箱中静置培养2天，不进行旋转。

2. 在CAM上移植肿瘤细胞（预计耗时：1小时30分钟，第10天）

1. 在细胞移植前 48 小时，将所需细胞接种于培养板中。为在 CAM 上形成三维肿瘤，UM-SCC-1 细胞按每枚鸡蛋 0.5 至 1 × 10⁶ 个细胞计算。注意不同细胞系所需细胞数量可能有所不同。
2. 吸除培养基，加入含 1% 青霉素-链霉素、10% 胎牛血清和 2.5 µg/mL 绿色荧光染料的 DMEM 培养基。在细胞培养箱中 37 °C 孵育 1 小时。随后在显微镜下观察荧光强度，吸除培养基，用 1× PBS 洗涤一次，加入 0.25% 胰蛋白酶消化最多 10 分钟。用添加了补充物的 DMEM 培养基中和胰蛋白酶。
3. 以 250 × g 离心 4 分钟，使细胞沉淀。吸除 DMEM 培养基，用 HBSS 重悬以洗去多余的荧光染料。使用血细胞计数板对细胞进行计数。
4. 将鸡蛋转移至细胞培养超净台中。使用剪刀和镊子打开覆盖在鸡蛋表面的透明薄膜敷料（图 1E-F）。
5. 将计算好数量的细胞再次离心，吸除 HBSS 培养基，并以相同培养基重悬，最终浓度为每 5 µL 含 0.5 至 1 × 10⁶ 个细胞（图 1G）。根据所需处理的鸡蛋总数准备相应体积的细胞悬液（每枚鸡蛋 5 µL 细胞悬液）。
6. 将 5 µL 细胞悬液滴加至 CAM 上，距离背根神经节（DRG）约 2 mm 处（图 1H）。保持 DRG 与细胞之间的距离一致。操作时需格外小心，避免扰动鸡蛋，以尽量减少细胞扩散。
   注意：开始细胞植入时，应选择 CAM 表面视觉上干燥的鸡蛋。若表面过于湿润，细胞易扩散，无法形成规则的肿瘤。
7. 按照 步骤 1.4 的方法，用新的薄膜敷料覆盖鸡蛋。对所有鸡蛋完成细胞移植后，将其置于 38 °C、54% 湿度的恒温培养箱中孵育 7 天，期间不旋转鸡蛋。

结果

图1：DRG移植、细胞接种及CAM收获流程：第8天：A. 去除石蜡膜后可清晰观察到CAM。B-C. 使用精细镊子将DRG放置于CAM上。D. 鸡蛋覆盖薄膜敷料后放入培养箱；箭头指示被覆盖的开口位置。第10天：E-F. 移除薄膜敷料并定位DRG（F图中箭头所示）。G-H. 在距离DRG约2 mm处，将5 µL细胞悬液滴加至CAM上。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
孵蛋器	GQF Digital Sportsman	#1502	配备自动旋转器、数字温控器和湿度控制的孵蛋器
雕刻切割头	DREMEL	#108	用于钻穿蛋壳
超细格拉夫镊子，弯型	Fine Science Tools (FST)	#11151-10	用于第8天将背根神经节（DRG）移植到绒毛尿囊膜（CAM）上，以及第17天收获CAM组织
超细格拉夫镊子，直型	Fine Science Tools (FST)	#11150-10	用于第8天将背根神经节（DRG）移植到绒毛尿囊膜（CAM）上，以及第17天收获CAM组织
受精洛曼白来航鸡蛋			受精后早期的受精蛋，最好为受精后第一天。本实验方案所用鸡蛋来自密歇根州立大学家禽农场。
滤膜镊	EMD Millipore	#XX6200006P	钝头镊子，用于移除蛋壳
HBSS (1x)	Gibco	#14025-092	Hank's 平衡盐溶液
石蜡膜	Parafilm 实验室封口膜	#PM-996	用于在第8天DRG移植前暂时覆盖蛋壳开口
PBS (1x) pH 7.4	Gibco	#10010-023	磷酸盐缓冲液
Tegaderm 透明薄膜敷料	3M	#9505W	无菌，6×7 cm，用于在孵育期间覆盖蛋壳开口