使用miRNA抑制剂模拟肿瘤内治疗：一种在小鼠模型中分析miRNA抑制剂对肿瘤生长影响的方法

摘要

来源：Ramirez-Moya, J. 等. 体内抑制微小RNA以减少小鼠肿瘤生长。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了在原位小鼠模型中将miRNA抑制剂作为抗肿瘤生长治疗剂的体内递送方法。通过瘤内注射合成的miRNA抑制剂（antagomiR），可使其结合并抑制内源性miRNA，从而导致mRNA上调并抑制肿瘤生长。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 细胞 flank 接种及瘤内 antagomiR 治疗

1. 细胞准备
   1. 构建Cal62人甲状腺癌细胞系（携带KRASG12R和p53A161D突变），使其过表达一种可组成型表达GFP和荧光素酶的转基因构建体（CMV-萤火虫荧光素酶-IRES-eGFP）。通过抗生素抗性筛选或流式细胞术分选GFP阳性细胞，获得稳定转染的细胞。
   2. 将细胞培养于添加青霉素、链霉素和10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，置于37 °C、5% CO₂条件下培养。
   3. 将1 × 10⁶个细胞悬浮于50 μL、4 °C的磷酸盐缓冲液（PBS）中。
2. 将细胞接种至小鼠侧 flank 区域
   1. 将细胞与等体积的基底膜基质混合。例如，将50 μL PBS中的1 × 10⁶个细胞加入50 μL基底膜基质中（参见材料表），并轻轻混匀。
   2. 使用1 mL胰岛素注射器配合27G 1/2''（0.4×13 mm）针头，将100 μL样品（PBS中的细胞+基底膜基质）皮下注射至6周龄免疫缺陷型BALB/c nu/nu小鼠的左侧 flank 区域。
3. 瘤内注射antagomiR处理
   1. 将antagomiR（参见材料表）或阴性对照物溶解于500 μL无RNase的去离子水中。
   2. 注射前，为每次注射准备2 nmol的antagomiR或对照物，并与体内递送试剂（参见材料表）配制。
      1. 首先将antagomiR溶液（参见材料表）与复合缓冲液（参见材料表）按1:1比例混合。例如，将80 μL miRNA抑制剂溶液（16 nmol）加入80 μL复合缓冲液中（该缓冲液包含于体内递送试剂盒中，参见材料表）。
      2. 将体内递送试剂恢复至室温。取160 μL加入1.5 mL离心管中，立即加入160 μL稀释后的antagomiR溶液。将剩余试剂放回-20 °C保存。如需，解冻后可在4 °C保存最多一周。
      3. 立即涡旋振荡（10秒），确保体内递送试剂与antagomiR充分形成复合物。
      4. 将体内递送试剂-antagomiR混合物在50 °C孵育30分钟。短暂离心以收集管壁液体。
      5. 加入1360 μL pH 7.4的PBS，将复合物稀释6倍，并充分混匀。
      6. 立即进行体内递送（每组8只小鼠），或将复合物在4 °C保存最多一周后再行注射。每瘤注射200 μL（含2 nmol antagomiR）。
         注意：antagomiR的注射体积和剂量与肿瘤体积无关。
   3. 每周进行3次处理（周一、周三、周五），持续2周。
4. 肿瘤生长分析
   1. 在每个时间点，使用1 mL注射器配合27G 1/2''（0.4 mm × 13 mm）针头，皮下注射50 μL浓度为40 mg/mL的D-荧光素底物溶液（参见材料表）。
      1. 注射后8分钟，使用3%异氟烷与氧气混合气体麻醉小鼠。通过足底反射（用力捏脚趾）评估麻醉深度，并根据需要调节麻醉气体流量以维持手术麻醉水平。
      2. 在双眼涂抹眼用软膏，防止角膜干燥。
5. 使用活体成像软件（参见材料表）采集生物发光信号。
   注意：也可使用游标卡尺测量肿瘤体积并评估肿瘤生长情况。
6. 获得生物发光信号后，比较两种处理组的肿瘤生长情况，并采用t检验确定差异的显著性。组内变异分析使用标准误（SEM）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
基底膜基质：Matrigel 基底膜基质高浓度	Corning	#354248
抗 microRNA：mirVana miRNA 抑制剂	Thermo Fisher	4464088	适用于活体
活体递送试剂：Invivofectamine 3.0 试剂	Thermo Fisher	IVF 3005
阴性对照：mirVana miRNA 抑制剂，阴性对照 #1	Thermo Fisher	4464077	适用于活体
XenoLight D-荧光素钾盐生物发光底物	PerkinElmer	122799	用 PBS 稀释
活体成像软件：IVIS Lumina II 成像系统	Caliper Life Sciences