将三维类球体包埋于琼脂糖凝胶液滴中：一种用于保存类球体以进行下游分析的技术

摘要

来源：Rolver, M. G. 等. 评估癌细胞三维球状培养物中的细胞活力与死亡。J. Vis. Exp. (2019)

本视频介绍了将三维球状体包埋于琼脂糖凝胶液滴中以进行保存的技术。包埋后的三维球状体可用于后续分析。

方案

1. 三维球状体的包埋

1. 制备用于包埋类球体的琼脂糖凝胶（仅首次执行该方案时需要）
   1. 将1 g细菌琼脂与50 mL去离子水（ddH₂O）混合。
   2. 在微波炉中缓慢加热，直至细菌琼脂完全溶解并形成均一凝胶。切勿使凝胶沸腾。
   3. 将细菌琼脂在60 °C水浴中保温。
   4. 实验间期保存于4 °C环境中。
2. 类球体的包埋
   1. 第1天，针对每种实验条件，将至少12个类球体收集至1.5 mL离心管中。
   2. 用1 mL预冷的1× PBS洗涤一次。
   3. 加入1 mL 4%多聚甲醛以固定类球体。
      注意：多聚甲醛的操作应在通风橱中进行。
   4. 室温下孵育24小时。
   5. 第2天，将琼脂糖凝胶小心加热：将其置于盛有水的烧杯中，并放入微波炉加热。确保凝胶不沸腾。使用前将其置于60 °C的台式加热板上保温。
   6. 用1 mL预冷的1× PBS洗涤类球体两次。
   7. 吸除大部分1× PBS（保留约100 µL有助于后续操作）。
   8. 准备一支20 µL移液器，将枪头斜向剪开，以获得更尖且孔径更大的枪头（图1）。
      注意：下一步操作需迅速完成，以确保类球体高效转移并防止凝胶液滴凝固。若无加热金属块，建议先吸取类球体，再制备琼脂糖液滴（即调换步骤1.2.9和1.2.10的顺序）。
   9. 在载玻片上滴加一滴琼脂糖凝胶，并将载玻片置于预热的金属块上，防止琼脂糖凝固。
   10. 使用经改造的移液枪头（步骤1.2.8），尽可能多地吸取15–20 µL体积的类球体。
   11. 小心地将含有类球体的15–20 µL 1× PBS注入琼脂糖凝胶液滴中心，避免枪头接触载玻片。
       注意：此步骤稍具难度。若枪头在注入过程中接触载玻片，可能导致类球体丢失。建议先用有色液体练习整个制备凝胶液滴及注入的操作流程，以便观察液体是否穿透液滴并泄漏至载玻片表面。
   12. 在室温或4 °C孵育5–10分钟，使琼脂糖液滴硬化。当凝胶液滴已部分凝固（但仍较柔软）时，用手术刀小心地将凝胶从载玻片上推入塑料组织包埋盒中。
   13. 用70%乙醇覆盖塑料组织包埋盒。
       注意：此时类球体可直接使用，也可长期保存数月。
   14. 将包埋在琼脂糖中的类球体进行石蜡包埋，切片为2–3 µm厚的切片，随后进行苏木精-伊红染色或免疫组织化学染色。

结果

图 1： 类球体的固定、包埋及免疫组织化学分析。 （A）类球体包埋实验流程的示意图。各步骤标记为（i–vii）。（B）MDA-MB-231 类球体包埋后的图像。比例尺：50 µm。（C）经化疗药物处理的 MDA-MB-231 类球体进行免疫组织化学（IHC）分析的代表性图像，使用抗 p-53 抗体。虚线表示类球体的边界。比例尺 = 20 µm。（D, E）分别经 DMSO 或化疗药物处理的 MDA-MB-231 类球体的代表性图像（上、下图面板）...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细菌琼脂	BD Bioscience	#214010	用于琼脂糖凝胶制备
甲醛	VWR Chemicals	#9713.1000	用于细胞固定
Medim Uni-safe 包埋盒	Medim Histotechnologie	10-0114	用于储存包埋的球状体
Superfrost Ultra-Plus 黏附载玻片	Menzel-Gläser	#J3800AMNZ	用于包埋的显微镜玻璃载片
CellTiter-Glo 3D 细胞活力检测试剂盒	Promega	#G9681	用于细胞活力检测