从小鼠模型制备细胞外基质：一种制备去细胞化小鼠舌细胞外基质的有效方法

摘要

来源：Yao, Y. 等. 舌细胞外基质的制备及体外舌鳞状细胞癌的重建。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了利用脱细胞化方法制备小鼠舌部细胞外基质的过程，该方法包括将获取的舌组织依次暴露于一系列物理、化学和酶处理步骤中。最终获得的舌组织脱细胞支架保留了天然的细胞外基质成分，同时去除了细胞成分。

方案

所有涉及动物的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 舌细胞外基质（TEM）的制备

1. 通过颈椎脱位处死小鼠，使用无菌手术剪和镊子取出舌头。
2. 将舌头浸入75%乙醇中3分钟，然后将每条舌头放入含有1 mL 10 mM无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的1.5 mL离心管（EP管）中。
   注意：后续所有步骤中PBS的浓度与此步骤相同。
3. 冻融法细胞裂解：将装有舌头的EP管在-80 °C冷冻1小时，然后在室温下解冻45分钟，重复3个循环。
4. 使用手术针将每条舌头穿在一段外科缝线上，并用一小块无菌锡箔包裹缝线末端。在无菌条件下，于含有75%乙醇的3.5 cm或6 cm培养皿中进行操作。
   注意：每段外科缝线的适宜长度约为20 cm，每块锡箔的适宜大小约为0.3 cm² （1 cm × 0.3 cm）。舌头应靠近锡箔端穿入。
5. 在无菌条件下，于3.5 cm或6 cm培养皿中用3 mL无菌PBS冲洗每条舌头30秒。
6. 用超纯水洗涤 舌头：向一个广口瓶中加入250 mL无菌超纯水，并加入氨苄青霉素至终浓度为90 µg/mL。将舌头连同搅拌子一起放入瓶中，将瓶盖拧紧，使部分缝线留在瓶外。该操作需在无菌条件下进行。
   注意：考虑到缝线可能缠绕，最多可将5条舌头放入同一瓶中。缝线末端的锡箔用于防止舌头滑脱。通过调节瓶内缝线长度，使舌头距离瓶底约2 cm。此注意事项同样适用于步骤1.8、1.10、1.12和1.16。
7. 将瓶子置于磁力搅拌器上搅拌12小时。
8. 用NaCl溶液洗涤 舌头：向一个广口瓶中加入250 mL无菌1 M NaCl溶液，并加入氨苄青霉素至终浓度为90 µg/mL。将舌头和搅拌子转移至瓶中，将瓶盖拧紧，使部分缝线留在瓶外。该操作需在无菌条件下进行。
9. 将瓶子置于磁力搅拌器上搅拌24小时。
10. 用Triton X-100进行细胞裂解：向一个广口瓶中加入250 mL含2% Triton X-100的无菌PBS，并加入氨苄青霉素至终浓度为90 µg/mL。将舌头和搅拌子转移至瓶中，将瓶盖拧紧，使部分缝线留在瓶外。该操作需在无菌条件下进行。
11. 将瓶子置于磁力搅拌器上搅拌48小时。
12. 用CaCl₂/MgCl₂溶液洗涤 舌头：向一个广口瓶中加入250 mL无菌5 mM CaCl₂/MgCl₂ 溶液，并加入氨苄青霉素至终浓度为90 µg/mL。将舌头和搅拌子转移至瓶中，将瓶盖拧紧，使部分缝线留在瓶外。该操作需在无菌条件下进行。
13. 将瓶子置于磁力搅拌器上搅拌24小时。
14. DNase消化：向每个EP管中加入1 mL汉克平衡盐溶液（HBSS），并分别向HBSS中加入DNase至终浓度为300 µM。将每条舌头转移至对应的EP管中，使部分缝线留在管外。该操作需在无菌条件下进行。
    注意：确保此前步骤中留在瓶内的缝线部分在此步骤中仍留在EP管内，此前留在瓶外的缝线部分也应继续留在EP管外。
15. 将装有舌头的EP管在37 °C孵育24小时。
16. 用PBS洗涤 舌头：向一个广口瓶中加入250 mL无菌PBS，并加入氨苄青霉素至终浓度为90 µg/mL。将舌头和搅拌子转移至瓶中，将瓶盖拧紧，使部分缝线留在瓶外。该操作需在无菌条件下进行。
17. 将瓶子置于磁力搅拌器上搅拌24小时。
18. 将制备好的组织工程化舌（TEM）保存在含无菌PBS的4 °C环境中，直至使用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57-BL/6J 小鼠	中山大学实验动物中心
乙醇	广州化学试剂厂	HB15-GR-2.5L
氯化钠	生工生物工程（上海）股份有限公司	A501218
磷酸氢二钠	广州化学试剂厂	BE14-GR-500G
磷酸二氢钾	生工生物工程（上海）股份有限公司	A501211
1.5 mL EP 管	Axygen	MCT-150-A
超低温冰箱	Thermo Fisher Scientific
3.5 cm 细胞培养皿	Thermo Fisher Scientific	153066
6 cm 细胞培养皿	Greiner	628160
Triton X-100	Sigma-Aldrich	V900502
氯化钙	Sigma-Aldrich	746495
氯化镁	Sigma-Aldrich	449164
DNase	Sigma-Aldrich	D5025
氨苄青霉素	Sigma-Aldrich	A9393
外科缝合线	上海金环
250 mL 广口瓶	SHUNIU	1407
磁力搅拌器	AS ONE	1-4602-32
二氧化碳培养箱	SHEL LAB	SCO5A
纯水仪	ELGA
Hepes 游离酸	BBI	A600264
4 °C 冰箱	海尔