脱细胞组织的低温研磨：一种制备细小细胞外基质粉末的技术

摘要

来源：Kornmuller, A. 等. 组织特异性细胞培养与递送平台用细胞外基质来源泡沫及微载体的制备 视频实验杂志 (2017)

在本视频中，我们展示了通过低温研磨冷冻干燥的脱细胞组织以获得精细研磨的细胞外基质粉末的实验方案。该粉末形式的细胞外基质可保持其生物化学组成，并可用于微载体的合成。

方案

1. 脱细胞组织处理

1. 脱细胞化与冷冻干燥
   1. 按照既定方案对目标组织进行脱细胞化处理。
      注意：本研究中的支架是依据已发表的人类深部肌腱（DAT）、猪深部真皮组织（DDT）和猪脱细胞瓣膜（DLV）的脱细胞化方案制备的。也可使用市售的不溶性胶原蛋白来制备泡沫或多孔微载体，例如来源于牛跟腱的胶原蛋白，在10–50 mg/mL浓度范围内已成功应用。其他来源的不溶性胶原蛋白亦可使用，但可能需要优化以确定能够形成稳定支架的有效浓度范围。
   2. 用镊子将水合状态的脱细胞化组织或纯化的胶原蛋白转移至50 mL离心管中，并加入足量的双蒸水（ddH₂O）以完全浸没组织，总体积最多不超过35 mL。
   3. 将样品在-80 °C条件下水平放置冷冻过夜，以在后续冷冻干燥过程中最大化升华表面积。
   4. 取下离心管盖，将冻结的样品转移至冷冻干燥瓶中。
   5. 使用实验室冷冻干燥机对样品进行冷冻干燥，持续48–72小时，或直至完全干燥。
      注意：干燥时间可能因不同的冷冻干燥设备和脱细胞化组织类型而异。
   6. 使用锋利的手术剪将冻干后的细胞外基质（ECM）精细剪切成小块（约1–2 mm³）。
   7. 将剪碎的ECM储存于干燥器中，待后续处理时使用。
      注意：建议尽快使用剪碎的ECM，以防其从环境中吸收水分。
2. 低温研磨（泡沫制备可选步骤）
   1. 将剪碎的冻干ECM装入实验室球磨系统的25 mL不锈钢研磨腔中，并加入两个直径为10 mm的不锈钢研磨球。
   2. 封闭研磨腔后，将其完全浸入液氮中3分钟。
   3. 在30 Hz（1,800 rpm）条件下研磨冻结样品3分钟。
   4. 重复步骤1.2.2和步骤1.2.3，直至ECM被研磨成细粉。
      注意：所需重复次数可能因ECM来源不同而异。例如，DAT通常需要3次研磨循环才能获得细粉。
   5. 使用药匙将粉末转移至玻璃小瓶中，密封后储存在干燥器中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
鳄鱼夹导线	VWR	470149-728
铝箔	赛默飞世尔科技	01-213-101
分析天平	Sartorius	CPA225D
冷冻研磨系统	Retsch	20.745.0001	MM 400
干燥器	赛默飞世尔科技	8624426	用于冻干细胞外基质（ECM）和生物支架的储存
杜瓦瓶	赛默飞世尔科技	10-196-6	矮型；容积范围为 250 - 500 mL
双蒸水（ddH2O）			来自 Barnstead GenPure xCAD 水纯化系统
ECM（细胞外基质）			从人脂肪组织、猪皮或猪心肌中分离获得，方法如 Flynn et al. 2010、Reing et al. 2010 和 Wainwright et al. 2010 所述
镊子	VWR	37-501-32	用于转移泡沫材料
冰箱（-20 °C）	VWR	97043-346
超低温冰箱（-80 °C）	Thermo Scientific	EXF40086A
玻璃小瓶	赛默飞世尔科技	03-339-26D	用于储存冻干后的冷冻研磨ECM
液氮			用于电喷雾
冻干机	Labconco	7750021	FreeZone4.5
研磨腔室	Retsch	02.462.0213	推荐容积为 25 mL
研磨球	VWR	16003-606	推荐直径为 10 mm，不锈钢材质
青霉素-链霉素	Life Technologies	15140-122	用于增殖培养基
Pipet-Aid XP 移液辅助器	Mandel Scientific	DRU-4-000-101
药匙	VWR	89259-968	用于收集微载体
手术剪刀	VWR	82027-590