细胞外基质悬液制备：一种从组织来源的细胞外基质获得均一悬液的技术

摘要

来源：Kornmuller, A. 等。利用细胞外基质制备组织特异性泡沫材料和微载体作为细胞培养与递送平台。J. Vis. Exp. (2017)

本视频介绍了从脱细胞化并冻干的组织中制备均质化且经消化的细胞外基质悬浮液的方法。该技术有助于制备来源于细胞外基质的多孔泡沫和微载体，可用于构建先进的三维细胞培养模型的基质。

方案

1. 脱细胞组织处理

1. 脱细胞化与冷冻干燥
   1. 按照既定方案对目标组织进行脱细胞化处理。
      注意：本研究中的支架是依据已发表的人源脱细胞脂肪组织（DAT）、猪源脱细胞真皮组织（DDT）和猪源脱细胞左心室组织（DLV）的脱细胞化方案制备的。也可使用市售的不溶性胶原蛋白来制备泡沫或多孔微载体，例如来源于牛跟腱的胶原蛋白，在10–50 mg/mL浓度范围内已成功应用。其他来源的不溶性胶原蛋白也可使用，但可能需要优化以确定可形成稳定支架的浓度范围。
   2. 用镊子将水合状态的脱细胞组织或纯化胶原转移至50 mL离心管中，并加入足量的双蒸水（ddH₂O）浸没组织，总体积最多为35 mL。
   3. 将样品在-80 °C下冷冻过夜，离心管应水平放置，以最大化后续冷冻干燥过程中升华的表面积。
   4. 取下离心管盖，将冻结的样品转移至冷冻干燥瓶中。
   5. 使用实验室冷冻干燥机对样品冷冻干燥48–72小时，或直至完全干燥。
      注意：干燥时间可能因不同的冷冻干燥设备和脱细胞组织类型而异。
   6. 使用锋利的手术剪将冻干的细胞外基质（ECM）精细剪切成小块（约1–2 mm³）。
   7. 将剪碎的ECM储存于干燥器中，待后续处理时使用。
      注意：建议立即使用剪碎的ECM，以防止其从环境中吸收水分。
2. 低温研磨
   1. 将剪碎的冻干ECM装入实验室球磨系统的25 mL不锈钢研磨腔中，并加入两个直径为10 mm的不锈钢研磨球。
   2. 封闭研磨腔，并将其完全浸入液氮中3分钟。
   3. 在30 Hz（1,800 rpm）条件下对冻结样品研磨3分钟，使其成为细粉。
      注意：不同ECM来源所需的重复研磨次数可能不同。例如，DAT通常需要3次研磨循环才能获得细粉。
3. ECM悬浮液的制备
   1. 称取250 mg剪碎的ECM（用于制备泡沫）或低温研磨后的ECM（用于制备泡沫或多孔微载体），转移至15 mL离心管中。分别参见步骤1.1.6和第1.2节以了解剪碎ECM和低温研磨ECM的制备方法。
      注意：本方案旨在制备50 mg/mL的ECM悬浮液，适用于人源DAT、猪源DDT和猪源DLV。根据具体的ECM来源，可能在更高或更低的起始浓度下也能形成均匀的悬浮液。
   2. 向离心管中加入5 mL 0.22 M NaH₂PO₄ （pH 5.4）缓冲液，并在管壁上标记液面位置。
   3. 通过将7.5 mg α-淀粉酶溶于1 mL 0.22 M NaH₂PO₄ （pH 5.4）缓冲液中配制α-淀粉酶储备液。取100 μL该储备液（含0.75 mg α-淀粉酶，相当于干组织质量的0.3% w/w）加入样品中，再加入0.22 M NaH₂PO₄ ，使最终体积达到10 mL。
   4. 在室温下以300 rpm持续振荡悬浮液72小时。
   5. 在1,500 x g条件下离心10分钟。小心收集并弃去上清液，避免扰动已消化的ECM沉淀。将沉淀物重悬于10 mL用ddH₂O稀释的5% NaCl溶液中。
   6. 重复步骤1.3.5，共用ddH₂O中的5% NaCl溶液清洗两次。
   7. 弃去上清液，将沉淀物重悬于10 mL ddH₂O中。
   8. 在室温下以300 rpm持续振荡悬浮液10分钟。
   9. 在1,500 x g条件下离心10分钟。小心收集并弃去上清液，避免扰动已消化的ECM沉淀。
   10. 加入0.2 M乙酸至步骤1.3.2中标记的5 mL刻度线处。
   11. 在37 °C下以120 rpm持续振荡过夜 。
   12. 在室温下使用配备10 mm锯齿探头的手持式匀浆器，以10秒为间隔对ECM悬浮液进行匀浆处理，直至无可见碎片残留。每次匀浆间隔之间将样品置于盛有冷水的烧杯中，以防过热。
       注意：根据ECM来源的不同，可能需要用0.2 M乙酸进一步稀释以获得均一的悬浮液。ECM悬浮液过度冷却可能导致黏度升高，影响匀浆效率。若观察到黏度升高，可将样品重新加热至37 °C后继续处理。
   13. 在制备泡沫或多孔微载体前，可于4 °C保存最多一个月。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
冰醋酸	BioShop	ACE222.5
αα-淀粉酶	Sigma	101074694	来自米曲霉
离心	赛默飞世尔科技	75004251	配有可摆动桶式转子，适用于15 &和 50 mL 离心管
离心管（15 mL）	Sarstedt	62.554.205
干燥器	Fisher Scientific	8624426	用于冻干 ECM 和生物支架的储存
双蒸水（ddH₂O）			来自 Barnstead GenPure xCAD 水纯化系统
细胞外基质（ECM）			从人脂肪组织、猪真皮或猪心肌中分离，如 Flynn 等 2010、Reing 等 2010 和 Wainwright 等 2010（参考文献 #28、8、32）所述
手持式匀浆器	Fisher Scientific	14-359-251	转速：8,000 - 30,000 rpm
匀浆器配件：锯齿形底部发生器探头	Fisher Scientific	14-261-17	10 x 95 毫米
液氮
氯化钠	BioShop	7647-14-5
磷酸二氢钠	BioShop	10049-21-5
手术剪	VWR	82027-590