通过电喷雾技术制备生物支架：一种由脱细胞组织细胞外基质制备微载体支架的方法

摘要

来源：Kornmuller, A. 等. 利用细胞外基质制备组织特异性泡沫材料与微载体作为细胞培养及递送平台. J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了通过电喷雾法制备细胞外基质来源的微载体的实验步骤。这些微载体可模拟天然组织特异性的微环境，并在长期三维体外细胞培养模型中保持稳定。

方案

1. 通过电喷雾法制备细胞外基质来源的微载体

注意：电喷雾装置的示意图见图1。

1. 将先前制备的冷冻研磨ECM悬浮液在37 °C下孵育，并以100 rpm持续振荡过夜（O/N）。
   注意：使用冷冻研磨ECM制备ECM来源的微载体，以确保悬浮液具有更高的均匀性，并防止在电喷雾过程中发生堵塞。
2. 将3 mL ECM悬浮液装入一个3 mL鲁尔锁型注射器中，并将带翅输液装置连接至注射器的内腔。
   注意：可使用多种规格的针头，需注意针头的选择可能影响最终微载体的尺寸和形状。为制备DAT、DDT和DLV微载体，请使用25G针头。
3. 将注射器固定于注射泵中。将针头用铁架台固定，并使针尖垂直，距离低型杜瓦瓶顶部4–6 cm（推荐使用250–500 mL容量的杜瓦瓶）。
4. 将一个鳄鱼夹电极连接至针头尖端，并将其连接至高压电源的正极端子。
5. 将一条铝箔（12 × 5 cm）折叠覆盖在真空瓶边缘。
6. 将第二个鳄鱼夹电极连接至铝箔外缘，并连接至电源的接地端子。
7. 向杜瓦瓶中加入液氮，至距离瓶口约1 cm处，使铝箔的¾部分浸没于液氮中。
   注意：必须保持杜瓦瓶内充满液氮。在电喷雾过程中，液氮液面不得低于瓶口2 cm以下。需持续补充液氮，以维持电喷雾期间液位恒定。
8. 将注射泵设定为30 mL/h的输注速率。
   注意：调节输注速率可改变微载体的形状和直径，推荐范围为25–35 mL/h。尽管具体效果高度依赖于悬浮液的黏度，但低于25 mL/h的流速可能导致生成更大的微载体。在极低流速下，微载体的尺寸和形状可能变得不均一。当输注速率超过35 mL/h时，电喷雾产生的液滴均匀性可能被破坏，导致微载体非球形且尺寸分布更广。
9. 施加20 kV电压，并启动注射泵以开始电喷雾。
   注意：可通过调节电压来调控微载体的尺寸，且电压对直径的影响通常大于输注速率。推荐电压范围为15–25 kV。随着电压升高，微载体直径预期减小。
10. 输注完成后，小心倾去杜瓦瓶中多余的液氮，保留微载体悬浮于约25 mL液氮中，以确保其保持冻结状态。
11. 立即通过一次性倾倒动作，将含有液氮的微载体转移至50 mL离心管中。使用刮勺收集杜瓦瓶内残留的冷冻微载体，并加入离心管中。
    注意：根据杜瓦瓶的尺寸，可先将含液氮的微载体倒入一个中等大小的容器中，再立即转移至50 mL离心管。
12. 用带有小孔的铝箔覆盖含有微载体和液氮的离心管，为后续冻干做准备。
13. 将盖好的离心管放入冻干瓶中。立即连接冻干机并过夜干燥样品。
    注意：至关重要的是，在此步骤前必须保持微载体悬浮于液氮中，防止其提前融化，因为融化可能导致结构塌陷和/或聚集。采用上述电喷雾条件、在35 mg/mL浓度下制备的DAT、DDT和DLV微载体，其水合状态下的直径通常在350–500 μm之间。尺寸分布可能因ECM来源不同而有所变化。
14. 将冻干后的微载体储存于干燥器中，待用时取出。

结果

图1. 微载体 fabrication 中所用电喷雾装置的概览。A：显示关键电喷雾设备布置的图像，包括注射泵和高压电源，以及针头相对于液氮杜瓦瓶的位置。B：电喷雾示意图，包含推荐的电压、进样速率和距离范围。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
鳄鱼夹导线	VWR	470149-728
铝箔	赛默飞世尔科技	01-213-101
离心管（15 mL）	Sarstedt	62.554.205
离心管（50 mL）	Sarstedt	62.547.205
干燥器 	赛默飞世尔科技 	8624426	 用于冻干细胞外基质（ECM）和生物支架的储存
杜瓦瓶	赛默飞世尔科技	10-196-6	矮型；容积范围为 250 - 500 mL
细胞外基质（ECM）			从人脂肪组织、猪皮或猪心肌中分离获得，方法如 Flynn 等 2010、Reing 等 2010 以及 Wainwright 等 2010 所述（参考文献编号 28、8、32）
液氮			用于电喷雾
冻干机	Labconco	7750021	FreeZone4.5
轨道摇床培养箱	SciLogex	8.3201E+11	温度可控（37 °C）
铁架台	VWR	470019-526
铁架台夹	VWR	21573-606
安全锁注射器	BD	309606	3 mL 鲁尔锁注射器，用于微载体的制备及细胞外基质悬液的分装
药匙	VWR	89259-968	用于收集微载体
注射泵	VWR	10117-490	微处理器控制
高压电源	Gamma High Voltage Research	ES30P-5W/DDPM	可提供推荐的 15 - 25 kV 电压范围
带翼输液器	Terumo	22258092	输液管长度 30 cm，推荐使用 25 G 3/4"；其他规格针头亦可使用，可能影响微载体直径