建立小鼠背根神经节与癌细胞的三维共培养模型：一种用于研究癌细胞神经周围侵袭的体外模型

摘要

来源：Huyett, P. 等. 头颈部鳞状细胞癌中神经周围浸润的模型。J. Vis. Exp. (2017)

在本视频中，我们演示了通过共培养小鼠背根神经节和嗜神经癌细胞来建立体外神经周围癌细胞侵袭模型的实验步骤。该模型可用于开展癌症检测实验，获得快速且可重复的结果。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 半固体基质液滴的制备（每块板 < 1 分钟）

1. 将预冷的玻璃底共聚焦培养皿放置在体视显微镜下方的冰块上。确保基质溶液始终置于冰上。
2. 使用 2 µL 或 10 µL 微量移液器，将 1.5 µL 基质液滴分别加入玻璃底培养皿的四个角落，液滴与玻璃孔边缘的距离应至少等于液滴本身的直径。
   1. 以 45 度角将移液器吸头直接接触玻璃表面，缓慢释放基质溶液；待基质在培养皿表面附着后，再缓慢移开吸头。
      注意：基质与玻璃之间的表面张力应每次形成一个完美的半球形液滴。
   2. 当吸头内液体即将排尽时即停止移液，避免将空气意外注入基质液滴中，否则会导致液滴直径显著增大且难以去除。
      注意：用另一只手稳定持移液器的手，有助于更精确地定位液滴。

2. 将DRG插入半固体基质液滴（< 2 min 每板）

1. 将含有基质液滴的培养板在室温下短暂放置（约1分钟）。这会使基质略微变硬，便于背根神经节（DRG）的精确定位。
2. 用左手持闭合的显微镊子轻轻舀取（不要夹取）DRG。同样，深色背景有助于观察微小的白色DRG。将DRG转移至右手所持21G针头的尖端。此转移过程会在镊子上留下残留液体。
3. 使用21G针头将DRG轻轻插入基质液滴中央（图1）。大多数情况下，DRG会顺利脱离针头进入基质中，随后可用针头将其调整至中央位置。
   1. 若DRG粘附在针头上，可用显微镊子将其从针头推入基质液滴中。用实验室擦拭纸吸去显微镊子上的多余液体。
      注意：将液体带入基质会改变检测体系的直径、体积和一致性。使用带有颜色或彩色标记的冰块作为背景可增强对比度，有助于观察这一精细操作过程。
4. 当培养板中所有四个DRG均放置完毕后，进行最终检查，确保每个DRG位于基质液滴的中心位置。如有需要，使用21G针头进行调整。
5. 将完成操作的培养板转移至37 °C培养箱中。这将使半固态基质固化，从而固定DRG的位置。
6. 对所有DRG重复上述操作。设置不含DRG的空白基质液滴作为阴性对照。
7. 完成所有培养板操作并将其在37 °C培养箱中放置至少3分钟后，向每孔玻璃底培养板中加入4 mL含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基。将培养板倾斜一定角度，缓慢加入培养基，使其逐渐接触基质-DRG单元。
   注意：若加入培养基过快或过于剧烈，可能导致基质和/或DRG移位。
8. 将检测体系在37 °C培养箱中继续培养48–72小时。
   注意：定期观察可发现神经突以同心圆方式向基质边缘延伸生长（图2）。当神经突延伸距离超过至基质边缘距离的四分之三时，即可进行细胞接种。

3. 头颈部癌细胞的制备

注意：除头颈部鳞状细胞癌细胞外，其他细胞系也可用于本实验设计。

1. 在37 °C培养箱中，使用含10% FBS的DMEM培养基，在适宜的培养瓶或培养皿中维持鳞状细胞癌细胞系。为准备实验用细胞，吸除培养瓶或培养皿中的全部培养基，并用PBS洗涤两次。加入适量0.025%胰蛋白酶消化5 min，使细胞悬浮，随后加入含10% FBS的DMEM终止消化。将4 mL细胞与培养基混合液接种至6 mL培养皿中。
   注意：即使细胞融合度低于50%，一个6 mL培养皿所提供的细胞数量也足以满足实验需求。
2. 在进行DRG实验染色和接种前24 h，将HNSCC细胞系暴露于不同的实验条件下。细胞接种后需再次施加相应处理，以维持稳定的实验环境。
   注意：在小鼠解剖并完成DRG植入基质后1–2天，向细胞培养皿中添加抗体、生长因子、细胞因子或其他分子。
3. 在细胞接种前1 h（即DRG收获并植入基质后2–3天）加入荧光细胞染料。
   注意：此处使用的特定染料可自由穿过细胞膜；但与细胞内巯基反应后，染料将保留在细胞内，并可传递至子代细胞。染色显著增强了实验中细胞的可视化效果。这些临时性染料非常适合本实验，因其荧光可持续2–3天，恰好覆盖实验所需的时间范围。此外，该染料支持多种不同颜色的使用，避免了构建荧光蛋白转染细胞系的需要。
   1. 每种细胞条件按2 mL无血清DMEM中加入2 µL 10 mM储存液的比例配制10 µM染料工作液。使用前将其预热至37 °C。
   2. 移除6 mL培养皿中的培养基，使贴壁的HNSCC细胞保留在皿中。加入2 mL磷酸盐缓冲液（PBS），随后吸除，并向每孔加入2 mL 10 µM染料/无血清DMEM混合液。
   3. 将含染料的6 mL培养皿放回37 °C培养箱中孵育40 min。
   4. 40 min后，吸除染色液，加入2 mL PBS，随后吸除。每皿加入1 mL 0.025%胰蛋白酶，并将培养皿放回37 °C培养箱。
   5. 3–5 min后，加入2 mL含10% FBS的DMEM终止消化，将悬浮细胞转移至15 mL锥形管中。离心细胞，再用1 mL含10% FBS的DMEM重悬。
   6. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞计数，随后加入含10% FBS的DMEM，调整细胞终浓度为300,000个细胞/mL。

4. 接种头颈部癌细胞

1. 从培养箱中取出带有基质-背根神经节（DRG）实验的玻璃底培养板。
   注意： 当神经突延伸至基质边缘距离的至少75%时，即可进行后续操作，通常发生在培养2–3天后。使用至少10倍物镜可清晰观察到该状态。
2. 吸除玻璃底培养板中的培养基。完全吸除玻璃孔内的培养基，但不得移除基质-DRG单元。
3. 使用200 µL移液器吸取200 µL浓度为300,000 cells/mL的细胞悬液。在每个基质-DRG实验区域上方滴加两滴细胞悬液。对每一份基质液滴均执行此步骤，使每种细胞处理条件在一块培养板上形成四个重复。
   注意： 基质的半球形结构可使细胞沿实验区域边缘沉降成环状分布 (图3a，图3b)。选用具有平滑按压手感的移液器可显著提高液滴均匀分布的操作便利性。
4. 在4倍显微镜下确认不同细胞处理条件之间的细胞数量及分布情况相似。
5. 将玻璃底培养板置于37 °C培养箱中孵育约60分钟。
   注意： 尽管细胞和培养基总体积较小（约150 µL），但在数小时的孵育时间内，实验体系不会发生干燥。
6. 60分钟后，沿玻璃底培养板侧壁轻轻加入4 mL含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基。
   注意： 随着时间推移，细胞会部分贴附于培养板底部，因此该加液方式不会扰动已定位的细胞。不同类型的细胞贴附于玻璃底板所需时间可能有所差异。
7. 此时应重新添加外源性药物或生长因子，以维持先前设定的浓度水平。
8. 除进行显微观察外，将实验样品继续放回37 °C培养箱中孵育。通过显微成像对实验结果进行定量分析。简而言之，利用4倍显微图像，在四个象限内分别计数出现神经周围侵袭的条索状结构。
   注意： 配备4倍物镜并具备荧光成像功能的显微镜足以完成实验的拍照记录。实验区域的尺寸与4倍物镜视野匹配良好，分辨率足以清晰捕捉各个独立的神经周围侵袭区域。神经周围侵袭现象通常在24小时内即可显现，但超过48小时后，实验体系的完整性开始下降，原因是肿瘤细胞在基质边缘增殖并发生侵袭。此外，超过48小时后，DRG中成纤维细胞大量迁移出，干扰明场显微镜下的观察效果。因此，建议在此时间窗口内至少进行两次4倍显微拍照记录（例如，在接种肿瘤细胞后24小时和48小时各一次）。需注意，这些是三维实验模型，难以对整个结构进行完全成像。大多数神经周围侵袭发生在贴近培养板底部的平面上，即细胞嵌入于略高于板底的基质层中。由于该平面接近水平方向，因此在4倍物镜下单层图像即可捕获绝大多数携带肿瘤细胞的神经突结构。

结果

图1. 背根神经节-基质实验。 背根神经节在基质液滴中的正确放置位置，通过4倍明场显微镜观察显示。比例尺代表1 mm。

图2. 神经突的生...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F-12 50/50 培养基（含 L-谷氨酰胺） & 15 mM HEPES	Corning Cellgro	10-090-CV	弗吉尼亚州马纳萨斯
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11150	美国佐治亚州弗劳里布兰奇
0.25% 胰蛋白酶-EDTA（1×）	Life Technologies Corporation	25200056	纽约州格兰德岛
1×磷酸盐缓冲液	康宁	21-040-CM	弗吉尼亚州马纳萨斯
Matrigel hESC-Qualif 小鼠	康宁公司	354277	马萨诸塞州贝德福德
经γ射线辐照的35 mm玻璃底培养皿	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	美国马萨诸塞州阿什兰
SteREO Discovery.V8 手术显微镜	卡尔·蔡司显微成像	495015-0021-000	纽约州索恩伍德
Schott ACE I 光源	Schott	A20500	德国
CellTracker	Life Technologies Corporation	C2925	加利福尼亚州卡尔斯巴德
BD PrecisionGlide 针头 21 G	BD	305195	新泽西州富兰克林湖