肿瘤侧群细胞鉴别实验：利用Hoechst染料外排实验分离肿瘤干细胞样细胞的方法

摘要

来源：Gilormini, M. 等. 具有干细胞特性的头颈部鳞状细胞癌亚群的分离与鉴定. J. Vis. Exp. (2016)

在本视频中，我们介绍了使用荧光激活细胞分选仪（FACS）从头颈部鳞状细胞癌细胞系中分离出一群具有癌干细胞样特性的亚群细胞。分离得到的侧群细胞可用于后续的下游分析。

方案

1. 通过Hoechst染料外排实验筛选侧群细胞（SP）

1. 使用 Hoechst 33342 染料染色 5000 万个细胞
   1. 准备两个带锥底的 15 mL 无菌管：一个标记为“Hoechst”，另一个标记为“Hoechst 和 Verapamil”。用无菌水配制 10 mL 的 5 mM 盐酸维拉帕米（Verapamil hydrochloride）溶液。准备干细胞培养基（CM）。
      1. 配制 CSC 培养基（CM-CSC）：将以下成分混合，即 DMEM/F12 培养基（1:3，v:v）、5% 胎牛血清（FCS）、0.04 mg/L 氢化可的松（hydrocortisone）、100 U/mL 青霉素（penicillin）、0.1 g/L 链霉素（streptomycin）以及 20 µg/L 表皮生长因子（Epidermal Growth Factor, EGFR）。
   2. 在超净工作台内对细胞进行胰酶消化。吸除培养基，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，然后为每瓶 75 cm² 培养瓶加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.5 g/L）。在 37 °C 下孵育 3 分钟。加入亲本细胞系所用的培养基以终止反应。使用细胞计数仪计数细胞数量。
      1. 配制亲本细胞系培养基（CM-P）：在 DMEM 培养基中添加 10% FCS、0.4 mg/L 氢化可的松、100 U/mL 青霉素和 0.1 g/L 链霉素。
   3. 将 步骤 1.1.2 获得的细胞悬液用 CM-P 稀释至 10⁷ 个细胞/mL。将细胞悬液分装至上述两个预置试管中：取 100 µL（含 10⁶ 个细胞）加入“Hoechst 和 Verapamil”管，4 mL（含 4 × 10⁷ 个细胞）加入“Hoechst”管。
   4. 在“Hoechst 和 Verapamil”样品中加入 10 µL 的 5 mM 盐酸维拉帕米溶液（终浓度为 0.5 mM），轻轻混匀。然后加入 5 µL 的 1 g/L Hoechst 溶液（终浓度为 0.1 g/L）。在“Hoechst”样品中，按每 10⁶ 个细胞加入 5 µL 的 1 g/L Hoechst 溶液（共 200 µL）。此后，所有样品均需用铝箔包裹以避免直接光照。
   5. 将所有试管置于 37 °C 水浴中孵育 1 小时 30 分钟。每隔 15 分钟轻轻混匀一次，防止细胞沉降。
   6. 在 4 °C 下以 250 ×g 离心 5 分钟。弃去上清液，每管沉淀用 2 mL 的 1× PBS 重悬。
   7. 在 4 °C 下以 250 ×g 离心 5 分钟。弃去上清液。将“Hoechst 和 Verapamil”管中的沉淀用 500 µL 含 5 mg/L 碘化丙啶（PI）的 PBS 缓冲液重悬，将“Hoechst”管中的沉淀用 4 mL 含 5 mg/L PI 的 PBS 缓冲液重悬。
   8. 将样品溶液通过 70 µm 细胞滤网过滤，以去除细胞团块，并将单细胞收集至流式细胞仪检测用试管中。样品需置于冰上，并用铝箔包裹以避免直接光照。

2. 通过细胞分选分离排除 Hoechst 染料的侧群细胞

1. 使用以下参数在流式细胞分选仪上进行Hoechst阴性细胞分离：紫外激光（355 nm），在紫外激光光路中配备两个检测器，分别带有蓝色Hoechst（450/50 BP）和红色Hoechst（610/20 BP）滤光片，以及两个收集器。
   1. 首先，分析用作染色和流式细胞仪设置阳性对照的“Hoechst”样品。
   2. 在细胞仪软件的“Global Worksheet”窗口中，点击“Dot Plot”（右上角第五个图标），在全局工作表上创建图表。纵坐标通过右键选择FSC-A（前向散射），横坐标选择SSC-A（侧向散射）（图1A）。以相同方式，创建SSC-W对SSC-H的散点图。在该第二个散点图上，点击“Polygon gate”（右上角第十四图标）创建P1区域（图1B）。
      注意：P1区域将包含单个细胞并排除双联体细胞。
   3. 可选：通过在P1门内创建FSC-A对PI的散点图，排除PI阳性细胞。在该散点图中选择PI阴性细胞群（P2），以排除PI阳性的死亡细胞。
   4. 在细胞仪软件的“Global Worksheet”窗口中，点击“Dot Plot”并在全局工作表上创建图表。纵坐标通过右键选择蓝色Hoechst-A，横坐标选择红色Hoechst-A。右键点击细胞群，选择“Show population”并选择P1。在此散点图上创建一个区域（P2），以选择位于主细胞群左侧、呈侧臂状的Hoechst染料阴性侧群（SP）细胞（图1C）。
2. 分析“Hoechst”样品并收集10,000个事件。为确保代表SP细胞群的P2门位置正确，需分析“Hoechst和维拉帕米”样品（10,000个事件），以观察SP细胞群的消失（图1D）。
3. 将Hoechst染料阴性的SP细胞收集至含有1 mL在步骤1.1.1中制备的CM-CSC的15 mL离心管中。
4. 细胞分选结束后，将细胞悬液在250 ×g条件下离心5分钟，弃去上清液，用1 mL CM-CSC重悬沉淀。使用细胞计数仪计数分选后的细胞数量，并将适量细胞转移至培养瓶中（见表1）。加入CM-CSC，于37 °C、5% CO₂条件下培养。
5. 在相同培养条件下维持细胞培养，最多传代两次，直至细胞数量达到至少5 × 10⁷个。

表1：根据分选细胞数量选择的培养瓶类型。 列出了对应大致分选细胞数量的培养瓶规格。同时提供了相应培养瓶类型所需的胰蛋白酶体积和培养基体积。

分选细胞数量	培养皿类型	胰蛋白酶体积 (mL)	培养基体积 (mL)
10,000-200,000	6孔板中的1孔或3.5 cm培养皿	0.5	2
200,000-1,000,000	1个T25培养瓶	1	4
>1,000,000	1个T75培养瓶	2	10

结果

图 1：排除 Hoechst 染料的侧群细胞的分离。（A）FSC-A 与 SSC-A 散点图。（B）SSC-W 与 SSC-H 散点图。（C、D）使用“Hoechst”管（C）或“Hoechst 与 Verapamil”管（D）进行的 Hoechst Red-A 与 Hoechst Blue-A 散点图。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胎牛血清 Gold	GE Healthcare	A15-151
水溶性氢化可的松	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
青霉素/链霉素 100x	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
F12 营养混合物 (1x) + GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
EGF	Promega	G5021	该溶液必须在使用前立即配制<br/>，因为它非常<br/>不稳定
肝素	StemcellTM Technologies	7980
B-27 添加剂 (50x)，不含<br/>维生素 A	Gibco	12587-010
青霉素/链霉素 100x	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
B-27 添加剂 (50x)，不含<br/>维生素 A	Gibco	12587-010
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	腐蚀性，急性毒性（经口、<br/>皮肤、吸入）类别 4
盐酸维拉帕米	Sigma-Aldrich	V-4629	急性毒性（经口、皮肤、<br/>吸入）类别 3
碘化丙啶	Sigma-Aldrich	P4170	急性毒性（经口、皮肤、<br/>吸入）类别 4
SQ20B 细胞系	由 John Little&rsquo;s<br/> 实验室惠赠	-
FaDu 细胞系	ATCC	HTB-43
BD FACSDiva 软件 v8.0.1	BD Biosciences	-