肿瘤侧群细胞鉴别实验：利用Hoechst染料外排实验分离肿瘤干细胞样细胞的方法

摘要

来源：Gilormini, M. 等. 具有干细胞特性的头颈部鳞状细胞癌亚群的分离与鉴定. J. Vis. Exp. (2016)

在本视频中，我们介绍了使用荧光激活细胞分选仪（FACS）从头颈部鳞状细胞癌细胞系中分离出一群具有癌干细胞样特性的亚群细胞。分离得到的侧群细胞可用于后续的下游分析。

方案

1. 通过Hoechst染料外排实验筛选侧群细胞（SP）

1. 使用 Hoechst 33342 染料染色 5000 万个细胞
   1. 准备两个带锥底的 15 mL 无菌管：一个标记为“Hoechst”，另一个标记为“Hoechst 和 Verapamil”。用无菌水配制 10 mL 的 5 mM 盐酸维拉帕米（Verapamil hydrochloride）溶液。准备干细胞培养基（CM）。
      1. 配制 CSC 培养基（CM-CSC）：将以下成分混合，即 DMEM/F12 培养基（1:3，v:v）、5% 胎牛血清（FCS）、0.04 mg/L 氢化可的松（hydrocortisone）、100 U/mL 青霉素（penicillin）、0.1 g/L 链霉素（streptomycin）以及 20 µg/L 表皮生长因子（Epidermal Growth Factor, EGFR）。
   2. 在超净工作台内对细胞进行胰酶消化。吸除培养基，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，然后为每瓶 75 cm² 培养瓶加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.5 g/L）。在 37 °C 下孵育 3 分钟。加入亲本细胞系所用的培养基以终止反应。使用细胞计数仪计数细胞数量。
      1. 配制亲本细胞系培养基（CM-P）：在 DMEM 培养基中添加 10% FCS、0.4 mg/L 氢化可的松、10....

结果

图 1：排除 Hoechst 染料的侧群细胞的分离。（A）FSC-A 与 SSC-A 散点图。（B）SSC-W 与 SSC-H 散点图。（C、D）使用“Hoechst”管（C）或“Hoechst 与 Verapamil”管（D）进行的 Hoechst Red-A 与 Hoechst Blue-A 散点图。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胎牛血清 Gold	GE Healthcare	A15-151
水溶性氢化可的松	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
青霉素/链霉素 100x	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
F12 营养混合物 (1x) + GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
EGF	Promega	G5021	该溶液必须在使用前立即配制<br/>，因为它非常<br/>不稳定
肝素	StemcellTM Technologies	7980
B-27 添加剂 (50x)，不含<br/>维生素 A	Gibco	12587-010
青霉素/链霉素 100x	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
B-27 添加剂 (50x)，不含<br/>维生素 A	Gibco	12587-010
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	腐蚀性，急性毒性（经口、<br/>皮肤、吸入）类别 4
盐酸维拉帕米	Sigma-Aldrich	V-4629	急性毒性（经口、皮肤、<br/>吸入）类别 3
碘化丙啶	Sigma-Aldrich	P4170	急性毒性（经口、皮肤、<br/>吸入）类别 4
SQ20B 细胞系	由 John Little&rsquo;s<br/> 实验室惠赠	-
FaDu 细胞系	ATCC	HTB-43
BD FACSDiva 软件 v8.0.1	BD Biosciences	-