甲基噻唑基四氮唑或MTT法：一种通过测定癌细胞代谢活性来衡量药物耐药性的比色法

摘要

来源：Sciarrillo, R. 等. 利用RNA测序检测体外癌症模型中与药物耐药性相关的新剪接变体. J. Vis. Exp. (2016)

本视频介绍了通过比色法——甲基噻唑四氮唑（MTT）法——检测药物诱导的癌细胞毒性并测定其代谢活性的实验方法。该方法基于四氮唑盐在细胞线粒体活性作用下转化为有色产物的代谢反应。

方案

1. 白血病细胞的 MTT 检测

1. 提前配制 MTT 溶液：将 500 mg MTT 甲臜溶解于 10 mL PBS 中，避光条件下使用磁力搅拌器搅拌约 1 小时。用 0.22 µm 滤器过滤除菌。
   注意：该溶液可分装为 10 mL 份量，于 −20 °C 保存。解冻后需避免直接光照。
2. 提前配制酸化异丙醇：向 2.5 L 异丙醇中加入 50 mL 2 M HCl。
   注意：配制后需在室温下存放至少一个月方可使用。若异丙醇未充分酸化，可能与培养基产生沉淀，影响分光光度读数。
3. 另准备一块 96 孔平底“第 0 天”（对照）板，以更准确地估算生长抑制率：每种细胞系分配 3 至 6 个孔，每孔加入 30 µL 培养基和 120 µL 细胞悬液（8,000 个细胞），空白孔（无细胞）则每孔加入 150 µL 培养基。随后执行本节的步骤 1.9至步骤 1.13，测定光密度（OD）。
4. 准备一块 96 孔平底实验板：分配 30 个孔用于药物浓度梯度（10 个浓度，每个设三个复孔），10 个孔用于对照细胞，10 个孔用于无细胞的培养基对照（空白孔），并使用二甲基亚砜作为溶剂配制地塞米松（Dex）的浓度梯度。
   注意：对于 CEM-WT 细胞，Dex 浓度范围为 2 µM 至 0.97 nM；对于 CEM/R30dm、CEM-R5 和 CEM-C3 细胞，Dex 浓度范围为 640 µM 至 0.33 nM。
5. 将各浓度 Dex 溶液各取 30 µL 加入 96 孔板的相应孔中。确保每个浓度设置三个复孔。
6. 向对应于对照细胞的孔中加入 30 µL 培养基，向空白孔中加入 150 µL 培养基。
7. 收集处于对数生长期的细胞，并重悬至其最佳接种浓度。
   注意：为确定最佳起始细胞浓度，建议在 96 孔板中以不同浓度接种细胞，连续每日检测至少 4 天，评估各细胞系的生长曲线。选择一种接种浓度，确保 72 小时后细胞不会过度生长，以免 OD 值饱和而影响实验结果。对于 CEM-WT、CEM-C5 和 CEM-R5 细胞，最佳接种浓度为每孔 8,000 个细胞；对于 CEM/R30dm 细胞，则为每孔 5,000 个细胞。
8. 向含有药物溶液或培养基（对应于对照细胞的孔）的各孔中加入 120 µL 细胞悬液。将板外周的空孔加入 150 µL PBS 以维持板内湿度，并将板置于 37 °C、5% CO₂ 的细胞培养箱中孵育 72 小时。
9. 向每孔加入 15 µL MTT 溶液，使用板式振荡器振荡 5 分钟，振荡频率最高可达 900 次/分钟。
10. 将板重新放回 37 °C、5% CO₂ 的细胞培养箱中，继续孵育 4–6 小时。
11. 向每孔加入 150 µL 酸化异丙醇，并使用多通道移液器充分混匀，彻底重悬所有甲臜结晶。从空白孔开始操作，每处理一行前应充分冲洗枪头。
12. 将板在室温（RT）下孵育 10 分钟。
13. 使用酶标仪测定 540 nm 和 720 nm 处的光密度（OD），通过校正背景 OD 值以确保测量准确。随后将数据保存至电子表格文件并进行分析。

2. MTT 实验的数据分析

1. 使用以下公式计算“第0天”的细胞OD值：
   OD_{Day 0} = OD_对照细胞 - 平均OD_空白孔
2. 根据以下公式计算每种药物浓度下存活细胞的百分比：
   % 处理组细胞 = 平均 [OD_{处理组细胞} - 平均OD_空白孔 - OD_{Day 0}] / [OD_对照细胞 - 平均OD_空白孔 - OD_Day0] × 100
3. 绘制剂量-反应曲线（药物浓度 vs. 生长抑制率%）。
4. 利用剂量-反应曲线计算抑制细胞生长50%所需的药物浓度（IC50）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CCRF-CEM	ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯	ATCC CCL-119
RPMI-1640	Gibco，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德	11875093
胎牛血清和小牛血清	Greiner Bio-One，德国弗里肯豪森	758093
青霉素G硫酸链霉素	Gibco，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德	15140122
三(羟甲基)氨基甲烷	Sigma Aldrich	252859
CELLSTAR 细胞培养瓶 25 平方厘米	Greiner Bio-One，德国弗里肯豪森	82051-074
MTT甲臜	Sigma Aldrich	M2003
Anthos-Elisa-reader 2001	Labtec，荷兰希尔霍沃瓦德		紫外-可见光96孔板分光光度计
Greiner CELLSTAR 96孔板	tes Greiner/Sigma	M0812-100EA
磷酸盐缓冲液（0.9% NaCl）	B.Braun Melsungen AG，德国	362 3140
胰蛋白酶/EDTA溶液 100 ml	Lonza，瑞士巴塞尔	CC-5012