利用DAPI染色进行细胞死亡筛选：一种快速筛选电离辐射诱导癌细胞系克隆性细胞死亡的方法

摘要

来源：Kobayashi, D. 等. 利用荧光显微镜一步法评估辐射诱导克隆性细胞死亡模式的实验方案. J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了利用DAPI染色法对电离辐射（IR）诱导的癌细胞系中的主要细胞死亡特征进行筛选的方法。发生细胞死亡的靶细胞经DAPI染色后，其细胞核呈现明显的形态学变化，可通过荧光显微镜轻松识别。

方案

1. 材料准备

1. 高压灭菌盖玻片
   1. 将盖玻片放入玻璃烧杯中。
   2. 用铝箔覆盖玻璃烧杯。
   3. 在121 °C、15 psi条件下高压灭菌20分钟。
   4. 在50 °C下干燥，于室温下存放于超净工作台中。
2. 配制固定液：含2%蔗糖的3%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）
   1. 向一个1,000 mL玻璃瓶中加入700 mL PBS和30 g多聚甲醛。
      注意：多聚甲醛具有腐蚀性，操作时应佩戴合适的手套。
   2. 使用微波炉加热至80 °C，使多聚甲醛完全溶解。
      注意：多聚甲醛蒸气有毒，操作时应佩戴口罩。
   3. 室温静置过夜。
   4. 加入20 g蔗糖。
   5. 加入PBS定容至1 L。
   6. 分装至50 mL离心管中。固定液可在-20 °C保存3年，或在4 °C保存3个月。

2. 照射

注意：请根据制造商的说明小心操作X射线辐照仪。

1. 在倒置相差显微镜下观察细胞，确认细胞已贴附于盖玻片且存活。
2. 使用6 Gy X射线（1.4 Gy/min，300 KVP，20 mA）照射培养皿。
3. 在含5% CO₂的环境中，37 °C孵育72小时。
   注意：孵育时间可根据实验设计进行调整

3. 固定

1. 从培养皿中吸除培养基。
2. 使用剪刀，在1,000 μL移液器吸头末端5 mm处剪去吸头尖端。
   注意： 剪切后的吸头有助于平缓地加入固定液。
3. 使用剪切后的吸头，从培养皿侧壁加入1 mL固定液（按步骤1.2中所述配制）。
   注意： 此步骤对时间敏感，因此在处理多个样品时应避免更换移液器吸头。直接将固定液加至培养皿底部可能损伤细胞。
4. 将培养皿放入方形培养皿中，轻轻摇动方形培养皿，使固定液均匀覆盖盖玻片。
5. 室温孵育10分钟。
6. 从培养皿中吸除固定液。
7. 从培养皿侧壁加入2 mL PBS。
   注意： 直接将PBS加至培养皿底部可能损伤细胞。
8. 从培养皿中吸除PBS。
9. 重复步骤3.7和3.8两次。
   注意： 培养皿可在4 °C条件下储存1周，期间盖玻片浸没于2 mL PBS中。

4. DAPI 染色

1. 在载玻片上加入 5 μL 浓度为 1 μg/mL 的 DAPI 染色试剂。
   注意： DAPI 染色试剂在避光且储存温度为或低于 -20 °C 的条件下可保持稳定达 6 个月。
2. 使用手术刀从培养皿中取下盖玻片。
3. 用纸巾轻触盖玻片边缘，吸去多余的 PBS。
4. 将盖玻片细胞面朝下倒置贴附于载玻片上的 DAPI 染色试剂液滴上，使细胞与 DAPI 染色试剂接触。
   注意： 此步骤对时间敏感。若 DAPI 染色试剂干燥，可能导致染色效果不理想。
5. 样品可在 -20 °C 下保存长达 1 年。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盖玻片	Matsunami	C013001
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148-1KG
蔗糖	Sigma-Aldrich	84097-250G
磷酸盐缓冲液	Cosmo Bio	16232000
手术刀	Kai Medical	No.20, 520-A
35 mm 细胞培养皿	Falcon	353001
倒置相差显微镜	Shimazu	114-909
X射线辐照仪	Faxitron Bioptics	Faxitron RX-650
方形培养皿	Corning	431110
载玻片	Matsunami	Pro-11
DAPI染色试剂	Cell Signaling	8961S
荧光显微镜	Nikon	ECLIPSE Ni
荧光显微镜 DAPI 滤光片	Nikon	U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410
荧光显微镜物镜（20×）	Nikon	Plan Apo λ 20X/0.75
荧光显微镜物镜（60×，油镜）	Nikon	Plan Apo λ 60X/1.40 oil
镜油	Olympus	N5218600
CCD相机	Nikon	DS-Qi2
数字图像采集软件	Nikon	NIS-Elements Document
镜头清洁剂	Olympus	OT0552
氯仿	Wako	035-02616