脱细胞猪食管支架制备：一种由猪食管生成无细胞支架的技术

摘要

来源：Green, N. H. 等. 三维组织工程人食管黏膜模型的构建、表征及其潜在应用。J. Vis. Exp. (2015)

在本视频中，我们演示了制备一种脱细胞猪食管支架的方法，该支架保留了其生化结构和组成，可用于组织工程应用。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 脱细胞食管支架的制备

1. 从用于食品生产的长白猪屠宰后的新鲜屠宰场获取完整的猪食管。单个食管可为约30个独立构建体提供足够的支架材料。
   注意：由于所需的灭菌程序复杂且耗时，通常建议一次获取并处理至少10根食管。
2. 立即将 freshly 切取的食管放入含有约150 mL 10%聚维酮碘溶液的180 mL无菌容器中，浸泡5分钟，以减少可能的微生物污染。随后将食管转移至第二个含有约100 mL无菌PBS的容器中，该PBS中含有200 IU/mL青霉素、200 µg/mL链霉素和1.25 µg/mL两性霉素B。
   1. 盖上容器盖子，并在室温下将食管运回实验室。根据食管大小，每个容器可运输两到三根食管。
3. 到达实验室后，在层流罩内采用无菌技术操作组织，以最大限度减少微生物污染。将镊子、剪刀和手术刀片在70%乙醇中浸泡5分钟进行消毒，然后用无菌PBS冲洗。
4. 使用无菌镊子夹持食管，用剪刀沿纵轴切开食管。将组织放入含有约100 mL无菌PBS的180 mL无菌容器中，轻轻振荡以去除碎片，从而清洗组织。
5. 用大量70%乙醇喷洒软木解剖板进行清洁，并使其自然干燥。
6. 从PBS中取出食管，使用无菌针将其固定在板上，黏膜面朝上。用无菌镊子夹住食管一端的黏膜表面并轻轻拉离板面，使黏膜与下方的黏膜下层分离。
   1. 然后使用无菌手术刀片沿固有层纵向解剖食管，在解剖过程中逐步移除固定针，以便将黏膜完全剥离。
7. 保留已分离的黏膜，丢弃下方的黏膜下层。
8. 切除并丢弃黏膜最近端和远端各2 cm的部分，因为这些区域分别含有更多的黏膜下腺体和更厚的固有层。
9. 使用手术刀将剩余组织切成5 cm²大小的片状。将所有切割后的组织放入含有约150 mL无菌PBS的180 mL无菌容器中，轻轻振荡以清洗组织。若同时处理超过五根食管，可能需要在本步骤及后续三个步骤中使用多个容器。
10. 使用无菌镊子将切割后的组织转移至含有150 mL无菌1 M NaCl、200 IU/mL青霉素、200 µg/mL链霉素和1.25 µg/mL两性霉素B的180 mL无菌容器中。在37 °C下孵育72小时。
11. 将组织放入新的180 mL无菌容器中，加入150 mL无菌PBS。此时上皮层将开始明显与下方组织分离。使用无菌镊子轻轻剥离脱落的上皮层并丢弃。
    1. 将剩余组织放入一个新的180 mL无菌容器中，加入150 mL无菌PBS，轻轻振荡5分钟进行清洗。倒去PBS，并用新鲜PBS重复清洗两次。
12. 将所有组织放入含有400 mL无菌80% (v/v)甘油溶液的500 mL玻璃瓶中，在室温下处理24小时。随后转移至含有400 mL无菌90% (v/v)甘油溶液的玻璃瓶中，继续处理24小时。
13. 在室温下，将组织保存于400 mL无菌100%甘油溶液中至少4个月，以实现组织脱水和灭菌，同时保持基底膜的完整性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Labtech	LM-D1112	使用前在 37 °C 水浴中预热
Ham's F12	Labtech	LM-H1236	使用前在 37 °C 水浴中预热
胎牛血清	Labtech	FB-1090
表皮生长因子	R+D Systems	236-EG-200	用 10 mM 乙酸、1% FCS 配制 200 µg/ml 储存液
霍乱毒素	Sigma-Aldrich	C8052	用水配制储存液
L-谷氨酰胺	Sigma-Aldrich	G7513
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P0781
两性霉素 B	Gibco	15290-026	商品名 Fungizone
PBS	Oxoid	BR0014	将 1 片溶解于 100 ml 水中，高压灭菌以达到无菌
胶原酶 A	Roche	10103578001
聚维酮碘溶液	Ecolab	10830E	商品名 Videne
乙醇	Sigma-Aldrich	E7023
Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901
新生牛血清	Gibco	26010074
15 ml 通用离心管	SLS	SLS7504
180 ml 烧杯	VWR	216-2603