从唾液腺组织培养唾液球：一种由人唾液腺来源的上皮细胞生成唾液球的方法

摘要

来源：Beucler, M. J., Miller, W. E. 从人唾液腺中分离唾液上皮细胞用于在体外以唾液球或单层形式培养。J. Vis. Exp. (2019)

本视频介绍了唾液腺来源的三维球状体——唾液腺球（salispheres）的培养方案。这些唾液腺球可进一步用于评估头颈部癌症对患者唾液腺唾液分泌功能的影响。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 组织消化

1. 使用100 mm的组织培养皿，用经高压灭菌的解剖剪刀和外科镊子将组织机械剪切成约1–2 mm大小的细小碎片图1B, C应剪断组织块之间的结缔组织，以确保充分分离，并便于后续操作。
2. 向切碎的组织中加入6 mL dispase/collagenase溶液，于37°C孵育约30分钟至1小时。
3. 使用5 mL血清移液管吹打组织15–20次以破碎组织。
4. 37°C 下继续孵育 30 分钟至 1 小时。
5. 重复 步骤 1.3 和 1.4 两到三次，或直至组织呈匀浆状并能轻松通过移液管口（图1D).
   注意： 组织样本的起始大小以及组织切碎的精细程度将决定需要重复的次数 步骤 1.3 和 1.4通常，我们收到的组织大小约为1 cm × 1 cm。此外，可使用标准倒置组织培养显微镜监测组织解离过程，以追踪细胞从组织中解离的进展。小细胞簇是唾液腺细胞初始生长形成唾液球（salispheres）的理想形态。

2. 用基底膜基质包被孔板

注意：基底膜基质（BMM）应在使用前一天于4°C条件下过夜解冻。解冻后，BMM必须始终保持在冰上或4°C环境中，因为在较高温度下会迅速凝固（即形成凝胶）。此外，若样品在接种到BMM之前曾置于冰上冷却，需格外小心，因为低温样品会“融化”BMM，导致细胞直接暴露于塑料培养皿表面。

1. 将BMM （参见材料表） 缓慢移液至每个待包被的孔中。均匀且缓慢地将BMM分布在孔内。
   注意：通常，我们每孔使用500 μL的BMM（适用于6孔板），但可根据需要调整体积，用于其他规格的培养板（如12孔板或24孔板），或制备更厚或更薄的水凝胶。
2. 包被后的培养板在使用前于37°C孵育至少15分钟，以使BMM充分凝固。

3. 未消化组织的过滤、红细胞裂解和细胞接种

1. 将组织匀浆从 步骤1.5 加入15 mL圆锥形管中。用6 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤培养板一次，以转移残留的细胞。
2. 将匀浆液通过70 μm尼龙网细胞滤筛过滤至50 mL锥形管中，以去除未消化的组织。将滤过的细胞在500 x g条件下离心5分钟。 g.
3. 将10倍浓度的红细胞裂解缓冲液用无菌去离子水稀释₂O 以配制 1x 工作液。
4. 吸弃上清液。然后将细胞沉淀重悬于10 mL 1x RBC裂解缓冲液中，37°C孵育5分钟。
5. 加入 20–25 mL DPBS 以中和红细胞裂解缓冲液，减少唾液细胞的裂解。在 500 x g 条件下离心 5 分钟 g.
   注意： 经红细胞裂解缓冲液处理后，细胞沉淀应呈白色。若沉淀呈现红色，表明红细胞未完全裂解，需重复操作。 步骤 3.4 通过 3.5 如有需要，可确保所有红细胞完全裂解。
6. 吸弃上清液。每孔用1–2 mL BEGM重悬沉淀，然后将重悬的细胞接种至BMM包被的孔中。37°C孵育。
7. 接种于BMM上后，细胞将在2–3天内形成球形结构，即“唾液球”（salispheres）。唾液球可维持培养约5–7天，随后BMM开始降解，使细胞得以接触并黏附于塑料表面，进而以单层形式生长。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mm 培养皿	Thermo Scientific	172931
15 mL 圆锥形离心管	Thermo Scientific	339651
50 mL 圆锥形离心管	Thermo Scientific	339653
支气管上皮细胞生长培养基	Lonza	CC-3171	根据制造商说明添加补充剂试剂盒。加入 20 mL 去除活性炭的胎牛血清进行补充。
70 µm 尼龙网细胞筛	Fisher	22-363-548
去除活性炭的胎牛血清	Gibco	12676-029
III 型胶原酶	Worthington	LS004182	在 4 °C 下保存。
中性蛋白酶	Cell Applications	7923	将胶原酶溶解配制成 0.15% (w/v) 的储备液。过滤除菌后于 -20 °C 保存。
解剖剪	Fisher	08-940
杜氏磷酸盐缓冲液	Corning	55-031-PC
PathClear 基底膜提取物	Cultrex	3432-005-01	使用前至少在 4 °C 融化 24 小时。操作时始终置于冰上。
六孔培养板	Falcon	353046
手术镊	Fisher	22-079-742