基于抗体偶联纳米颗粒与暗场显微镜的定量方法：一种从体液中捕获并定量特定外泌体的实验流程

摘要

来源：Wan, M. 等. 利用纳米等离子体增强散射与低倍显微镜成像定量肿瘤来源的外泌体. J. Vis. Exp. (2019)

本视频介绍了利用低倍暗场显微镜对微量生物流体样本中的特定外泌体进行定量分析的方法。所鉴定的外泌体可作为潜在的癌症生物标志物。

方案

1. 纳米粒子探针的制备

注意：本实验采用功能化金纳米棒（AuNRs；直径25 nm，长度71 nm），其表面共价结合了中性亲和素聚合物（AV），在暗场显微镜（DFM）照射下，表面等离子体共振峰产生红色散射信号（峰值波长为641 nm）。

1. 将40 µL AuNR-AV（2.56 × 10¹¹ 个颗粒）用200 µL PBS（pH 7.0）通过离心和吸除方式进行洗涤三次（4 °C下，8,500 × g 离心10分钟），最后一次离心并吸除上清后，将AuNR-AV沉淀重悬于40 µL PBS中。
2. 将上述AuNR-AV悬液与10 µL生物素化抗体（0.5 mg/mL）及150 µL PBS混合，该抗体特异性识别目标外泌体亚型表面的抗原；随后在4 °C下使用混匀仪孵育2小时，使中性亲和素-生物素结合反应完全进行。
3. 将所得的抗体偶联金纳米棒（AuNR-IgG）通过离心和吸除方式洗涤三次（4 °C下，6,500 × g 离心10分钟），然后重悬于200 µL PBS中，于4 °C保存备用。
   注意：必须采用无菌操作技术，并尽量缩短储存时间，以避免AuNR-IgG污染或降解。建议在抗体偶联后24小时内使用。

2. 外泌体捕获载玻片的制备

1. 用 PBS 将选定的外泌体捕获抗体稀释至 0.025 mg/mL，并将 1 µL/孔的该稀释液加入多孔蛋白 A/G 载玻片中，然后将载玻片置于湿盒中 37 °C 孵育 1 小时，使捕获抗体与固定在载玻片上的蛋白 A/G 结合。
2. 吸除未结合的抗体，通过每孔加入 1 µL PBS 并吸除的方式洗涤 3 次。随后每孔加入 1 µL 封闭缓冲液 （见 材料表），将载玻片置于湿盒中 37 °C 孵育 2 小时，以封闭剩余的蛋白结合位点。
3. 吸除封闭缓冲液，通过每孔加入 1 µL PBS 并吸除的方式洗涤 3 次，立即使用已封闭的载玻片进行外泌体捕获与分析。

3. 标准曲线制备

1. 为了准确定量特定外泌体亚型的绝对或相对丰度，用户必须使用均匀表达目标外泌体表面生物标志物的纯外泌体群体生成标准曲线。本研究分析表达与转移相关的膜蛋白Ephrin A2受体的外泌体的丰度，该蛋白已被报道与胰腺癌的分期和预后相关。
   注意：已知人胰腺癌细胞系PANC-1及其外泌体表达该蛋白，因此本研究使用该细胞系分离的外泌体生成标准曲线，以定量复杂外泌体样本中表达该蛋白的外泌体数量。
2. 在无血清培养基中于37 °C培养细胞48小时，使外泌体在培养基中积累，然后通过离心悬浮培养物或直接吸取贴壁细胞培养物的培养基来分离细胞培养上清液。
3. 将收集的培养基在2000 x g 下离心30分钟，以去除碎片，并回收上清液。
4. 使用适当容量的0.45 µm低蛋白结合滤器装置（例如250 mL聚醚砜真空过滤装置）过滤澄清后的培养上清液。
5. 使用标称分子量截留值为100,000的滤器系统，在3200 x g 下离心浓缩滤液至终体积250 µL。收集滤器中截留的液体，然后用200 µL PBS洗涤滤器，并将洗涤液与收集的外泌体样品合并。
6. 将此样品在21,000 x g 下离心45分钟，并小心回收上清液，注意避免收集任何沉淀物质。
7. 将回收的上清液在100,000 x g 下离心3小时，以沉淀外泌体。吸除上清液，并将外泌体沉淀重悬于100 µL PBS中。
8. 若在24小时内使用，将所得外泌体悬液储存于4 °C；如需长期保存，则储存于-80 °C。
   注意：避免对外泌体样品进行反复冻融。
9. 混匀后取部分外泌体悬液，通过直接测量外泌体数量（例如纳米颗粒追踪分析、可调电阻脉冲传感，或通过微量双辛可宁酸法测定外泌体裂解物的蛋白浓度，或其他等效方法）来估算外泌体数量。
10. 对外泌体悬液进行一系列连续稀释，以便将纳米颗粒信号与输入的外泌体数量或蛋白含量进行比较。
11. 将每种外泌体标准品各1 µL转移至检测板中的相应复孔中。
    注意：标准曲线可用于计算纳米颗粒信号与外泌体浓度之间相关性直线的斜率，以（1）评估检测性能，以及（2）确定实验样品中目标外泌体的相对浓度。

4. 人血浆或血清样本的处理

1. 采用标准方法收集血浆或血清样本，并于 -80 °C 保存，直至进行外泌体分析。在室温水浴中快速解冻样本。通过反复颠倒混匀，使解冻后的样本形成均匀悬浮液。
   注意：由于凝血过程中会大量释放外泌体，血清与血浆样本的检测结果可能不具等效性。
2. 将血浆或血清样本在 500 × g 条件下离心 15 分钟，以沉淀蛋白聚集体及其他碎片。取部分血浆或血清样本转移至新管中，加入 PBS 制备成 1:1 稀释液。根据需要，通过轻柔涡旋或颠倒混匀稀释后的样本。将每种血浆或血清悬浮液各取 1 µL 加入检测板中相应的复孔中。

5. 外泌体捕获与检测

1. 在已封闭的EV捕获载玻片的孔中加入外泌体样本，每孔1 µL，每个样本设8个复孔，于4 °C湿盒中孵育过夜。吸除所有样本孔中的液体，然后每孔加入1 µL PBS洗涤孔，以去除未结合的外泌体及其他污染物。
2. 向样本孔中加入先前制备的AuNR-IgG悬浮液，每孔1 µL （见上述第1节），于37 °C湿盒中孵育2小时。吸除纳米颗粒溶液，用含0.01% Tween-20的PBS（PBST）在振荡器上洗涤载玻片10分钟，随后吸除液体，再用去离子水在旋转混合器上洗涤所有样本孔10分钟，最后空气干燥，用于后续LMDFM成像。
   注意：通过同一样本的八个复孔评估批间变异系数（CV）。若样本CV值>20%，则视为无信息价值，如有足够样本应重复实验。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Eppendorf Repeater stream	Fisher Scientific	05-401-040
Eppendorf Research plus	Eppendorf	3120000011	0.1 – 2.5 µL，深灰色
功能化金纳米棒	Nanopartz	C12-25-650-TN-DIH-50-1	体外中性亲和素聚合 功能化
HulaMixer 样品混合器	Thermo Fisher Scientific	15920D
Incu-shaker 10L	Benchmark Scientific	H1010
倒置研究显微镜	Nikon	Ti-DH	配备暗场聚光镜、DS-Ri2 相机、Ti-SH-U 通用 样品夹及电动载物台
NIS-Elements	Nikon		显微镜成像软件
磷酸盐缓冲液（1X）	GE Healthcare Life Sciences	SH30256.02	HyClone
蛋白A/G处理的玻片 基底	Arrayit Corp.	AGMSM192BC	高品级微阵列基底
Q500 超声破碎仪	Qsonica, LLC	Q500-110	配备标准探头（#4220）
Superblock 封闭缓冲液	Thermo Scientific
TWEEN 20	Sigma Life Sciences	9005-64-5