使用暗场显微镜进行抗体偶联纳米颗粒定量:从体液中捕获和定量特定外泌体的程序

Abstract

来源:Wan， M. et al.使用纳米等离子体增强散射和低放大倍率显微镜成像来量化肿瘤衍生的外泌体。J. Vis. Exp.（2019 年）

该视频介绍了如何使用低放大倍率、暗场显微镜来定量小体积生物流体样品中的特定外泌体。这样鉴定的外泌体可以作为潜在的癌症生物标志物。

Protocol

1. 纳米粒子探针的制备

>注意:该测定利用与中性亲和素聚合物 （AV） 共价偶联的功能化金纳米棒（AuNR;直径 25 nm x 71 nm 长度），并具有表面等离子体共振峰，在 DFM 照射下产生红色（641 nm 峰）散射信号。

1. 用 200 μL PBS（pH 7.0）离心和吸液（4 °C 下 8,500 x g，持续 10 分钟）洗涤 40 μL AuNR-AV（2.56 x 10¹¹ 个颗粒）3 次，然后进行最后的离心和吸液步骤，然后将 AuNR-AV 沉淀悬浮在 40 μL PBS 中。
2. 将此 AuNR-AV 悬浮液与 10 μL 生物素化抗体 （0.5 mg/mL） 混合，该抗体对目标外泌体亚型表面的抗原具有特异性和 150 μL PBS，然后使用混合器在 4 °C 下混合 2 小时，以使中性亲和素-生物素结合完成。
3. 通过离心和抽吸（6,500 x g ，4 °C 持续 10 分钟）洗涤所得抗体偶联的 AuNR （AuNR-IgG） 3 次，然后将它们悬浮在 200 μL PBS 中并储存在 4 °C 直至使用><。 注意:必须使用无菌技术和较短的储存时间，以避免 AuNR-IgG 的污染和降解。最好在偶联后 24 小时内使用抗体偶联的 AuNR。

2. EV Capture 幻灯片的准备

1. 在 PBS 中将选定的外泌体捕获抗体稀释至 0.025 mg/mL，并将 1 μL/孔的稀释液添加到多孔蛋白 A/G 载玻片上，然后将该载玻片在 37 °C 下在加湿室中孵育 1 小时，以允许捕获抗体与固定在载玻片上的蛋白 A/G 结合。
2. 吸出孔以去除未结合的抗体，并通过添加和吸出 1 μL/孔的 PBS 来洗涤它们 3 次。然后，在每个孔中加载 1 μL 封闭缓冲液（参见材料表），并在加湿室中将载玻片在 37 °C 下孵育 2 小时，以封闭任何剩余的蛋白质结合位点。
3. 吸出孔以去除封闭缓冲液，通过添加和吸取 1 μL/孔的 PBS 洗涤孔 3 次，并立即使用封闭的载玻片进行外泌体捕获和分析。

3. 标准曲线准备

1. 为了准确量化特定外泌体亚型的绝对或相对丰度，用户必须生成一条标准曲线，其中包含均匀表达目标外泌体表面生物标志物的纯外泌体群体。本研究分析了表达转移相关膜蛋白肝配蛋白 A2 受体的外泌体的丰度，据报道该受体与胰腺癌分期和预后有关><。 注意:已知人胰腺癌细胞系 PANC-1 及其外泌体表达这种蛋白质，并且从该细胞系中分离的外泌体用于生成标准曲线，以量化复杂外泌体样品中表达该蛋白质的外泌体的数量。
2. 在 37 °C 下在无血清培养基中培养细胞 48 小时，以允许外泌体在培养基中积累，然后通过离心悬浮培养物或直接吸出贴壁细胞培养物中的培养基来分离细胞培养上清液。
3. 将收集的培养基以 2000 x g 离心 30 分钟以去除碎片并回收上清液。
4. 通过适当容量的 0.45 μm 低蛋白结合过滤装置（例如，250 mL 聚醚砜真空过滤装置）过滤澄清的培养上清液。
5. 使用 100,000 标称分子量极限过滤系统以 3200 x g 离心，将所得滤液浓缩至 250 μL 最终体积。从该过滤器中收集保留体积，然后用 200 μL PBS 洗涤过滤器，并将该洗涤体积与收集的外泌体样品体积混合。
以
6. 21,000 x g 的离心速度离心该样品 45 分钟，然后小心回收上清液，注意不要收集任何沉淀材料。
7. 将回收的上清液以 100,000 x g 离心 3 小时以沉淀外泌体。吸出上清液，并将外泌体沉淀收集在 100 μL PBS 中。
8. 如果在 24 小时内使用，请将所得外泌体悬浮液储存在 4 °C 下，或在 -80 °C 下长期储存><。 注意:不要让外泌体样品重复冻融循环。
9. 通过直接测量外泌体数量（例如，通过纳米颗粒跟踪分析或可调谐电阻脉冲传感或通过微量二辛可宁酸测定或等效方法测量外泌体裂解物的蛋白质浓度，作为近似外泌体数量的手段）定量混合后的外泌体悬浮液的等分试样。
10. 生成一组外泌体悬浮液的连续稀释液，以便将纳米颗粒信号与输入的外泌体数量或蛋白质含量进行比较。
11. 将 1 μL 每种外泌体标准品转移到检测板上的每个重复孔中。
    注:标准曲线可用于计算纳米颗粒信号和外泌体浓度之间相关线的斜率，以 （1） 评估测定性能和 （2） 确定实验样品中目标外泌体的相对浓度。

4. 处理人血浆或血清样品

1. 通过标准方法收集血浆或血清样品并储存在 -80 °C，直到需要进行外泌体分析。在室温水浴中快速解冻样品。通过倒置反复混合解冻的样品，以促进均匀的悬浮液><。 注:血清和血浆样品的结果可能不等效，因为在凝血反应过程中会大量释放外泌体。
2. 以 500 x g 离心血浆或血清样品 15 分钟，以沉淀蛋白质聚集体和其他碎片。将血浆或血清样品的等分试样转移到新试管中，并加入 PBS 以产生 1:1 稀释度。根据需要，通过轻轻涡旋或倒置来混合稀释的样品。将 1 μL 的每种血浆或血清悬液转移到检测板上的每个重复孔中。

5. 外泌体捕获和检测

1. 用 1 μL/孔的外泌体样品加载封闭的 EV 捕获载玻片的孔，每个样品使用 8 次重复，并将载玻片在 4 °C 下在加湿室中孵育过夜。吸出所有样品孔，然后加入 1 μL/孔 PBS 以洗涤孔，并从加载的外泌体样品中去除未结合的外泌体和其他污染物。
2. 用 1 μL/孔的先前制备的 AuNR-IgG 悬浮液（参见上文第 1 节）加载样品孔，并在加湿室中将载玻片在 37 °C 下孵育 2 小时。吸出纳米颗粒溶液，使用混合器在补充有 0.01% 吐温-20 （PBST） 的 PBS 中洗涤载玻片 10 分钟，然后使用旋转混合器吸出并用去离子水洗涤所有样品孔 10 分钟，然后风干以进行后续的 LMDFM 成像><。 注:批间变异系数 （CV） 是从同一样品的 8 个重复中评估的。CV >20% 的样本被认为没有信息，如果样本足够，应重复提供。

Materials