从小鼠中提取完整肾脏：一种从小鼠模型中获取无肾包膜肾脏的技术

摘要

来源：Grainger, N. 等 通过振动切片法分离并成像小鼠肾盂完整起搏区域的活体组织。J. Vis. Exp. (2021)

在本视频中，我们描述了从小鼠腹膜后间隙取出肾脏的操作步骤。取出的肾脏可进一步进行显微解剖，以获得一个不含肾包膜及周围脂肪层的完整肾脏。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 肾脏解剖

1. 在通风橱中通过吸入3–4%异氟烷对小鼠进行麻醉。通过脚趾和/或尾巴夹捏反射消失确认深度麻醉后，采用颈椎脱位法处死小鼠。
2. 用70%乙醇润湿胸部毛发。使用外部解剖剪，沿纵轴做切口打开腹腔，剪刀刀刃朝外倾斜，以避免损伤内脏器官。
3. 使用内部组织镊子和内部解剖剪，夹住肠道并将其从腹壁提起。在提起肠道的同时，于近端十二指肠和远端结肠处剪断肠道下方与体壁的连接，以暴露包含肾脏的腹膜后腔。
4. 暴露肾脏后，逐个取出。用组织镊子轻轻夹住输尿管远端（距肾脏约4 mm处）并提起。使用解剖剪从夹持处沿输尿管下方朝肾脏方向剪开。继续沿肾脏下方剪切，直至肾脏完全脱离周围结缔组织。
   注意：为了在振动切片过程中最大限度地保持组织完整性和切片一致性，肾脏应尽可能保持完整。为此，避免使用镊子或解剖剪夹捏或切割肾脏本身。
5. 将带有输尿管的肾脏置于冰冻的KRB溶液中。对另一侧肾脏重复上述提取步骤，从动物体内取出。将肾脏保持在冰上的KRB溶液中。
   注意：应立即进入实验方案的下一阶段，以维持肾小球旁器（PKJ）组织的活性。由于PKJ位于肾实质深部，难以直接接触KRB溶液。

2. 为振动切片机制备去肾包膜的肾脏

1. 将肾脏转移至涂有硅胶弹性体的解剖皿（60 mm × 15 mm）中，并加入冰冻 Krebs-Ringer 缓冲液（KRB），直至完全浸没肾脏。
2. 在解剖显微镜下，用 minutien 针穿过近端输尿管及肾前部薄层肾被膜或周围脂肪组织，将肾脏固定于皿底。
   注意：操作时需避免刺破肾实质组织。
3. 使用精细弹簧剪和内用镊子，从肾脏基底部去除脂肪组织，以暴露远端肾乳头（RP）和近端输尿管。
4. 使用精细弹簧剪，从肾乳头基部切除近端输尿管及部分远端肾乳头（RP）。
   注意：操作时需避免切割周围肾实质组织。图1A中的黑色虚线表示该切口的大致位置。此切口可为肾脏创建一个平整的基底，以实现更均匀的组织切片。在解剖肾脏时，必须注意肾乳头-肾盏连接区（PKJ 区域）的解剖位置。图1B显示，完整肾脏可沿矢状面切开，以暴露髓质、乳头（集合管汇聚的远端髓质）以及近端和远端肾乳头（RP）。若如图1C所示完全暴露乳头，则可观察到 PKJ 区域及近端肾乳头（prox RP）。但此操作不应在振动切片（vibratome）技术中进行；此处描述仅为帮助读者大致了解 PKJ 区域的位置，图1D、E中透射光图像所展示的 PKJ 区域与肾乳头中段区域（mid-RP）的解剖差异进一步强调了该结构定位。
5. 用尖头镊子刺穿外层肾被膜，镊尖方向应远离肾实质。双手各持一把镊子，夹住被膜松动的边缘并将其撕开，继续剥离剩余的肾被膜，直至完全去除。
   注意：肾被膜是一层坚韧的纤维层，包裹于肾脏表面。为获得最佳切片效果，必须在振动切片前将其完全去除。

结果

图1：肾脏基本解剖结构及PKJ起搏区域的位置。（A）完整肾脏示意图，显示肾盂（RP）和输尿管的方位。肾动脉和肾静脉分别以红色和蓝色表示。（B）沿矢状面切割完整肾脏，可暴露肾脏内部结构，包括髓质、乳头（集合管汇聚的远端髓质区域）以及近端和远端肾盂。（C）切除髓质和乳头后，可完全暴露盆肾连接部（PKJ）和近端肾盂（prox RP）。（D 和 E）分别为PKJ起搏区域和远端肾盂的透射光显微图像。沿肾盂远端连续切片时，PKJ区域的半月形...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
60 mm x 15 mm 培养皿	Sigma Aldrich	P5481	肾脏精细解剖皿
吸水纸	Fisher Scientific	06-666A	在应用<br/>胶水前干燥肾脏
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J	The Jackson Laboratory	13148	GCaMP3 小鼠
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J	The Jackson Laboratory	24105	GCaMP6f 小鼠
B6.FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J	The Jackson Laboratory	19079	smMHC-CRE 小鼠
C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J	The Jackson Laboratory	13148	PDGFRa-CRE 小鼠
乙醇	Phamco-Aaper	SDA 2B-6	用于解剖
超细邦恩剪刀	Fine Science Tools	14083-08	用作内部解剖剪
精细剪刀	Fine Science Tools	14060-09	用作外部解剖剪
细尖镊子	Fine Science Tools	11254-20	用于肾脏精细解剖
异氟烷	Baxter	NDC 1001936060	用于麻醉
硅弹性体	Fisher Scientific	NC9285739	Sylgard 184
学生型阿登森镊	Fine Science Tools	91106-12	用于轻柔夹持和移动<br/>肾脏
学生型杜蒙特镊	Fine Science Tools	91150-20	用作内部解剖镊
范纳斯弹簧剪	Fine Science Tools	15000-03	用于精细解剖和清理<br/>分离的肾脏