小鼠全肾振动切片：一种制备小鼠肾脏薄切片的技术

摘要

来源：Grainger, N. 等. 通过振动切片法分离并成像小鼠肾盂完整活体起搏区域. J. Vis. Exp. (2021)

在本视频中，我们演示了使用振动切片机对完整小鼠肾脏进行切片以获得薄片组织。这些切片后的组织样本可在低温下保存，直至进行后续下游分析。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医评审委员会的审核。

1. 配制溶液

1. 配制1 L含有120.35 mM NaCl、5.9 mM KCl、15.5 mM NaHCO₃、1.2 mM Na₂HPO₄、1.2 mM MgCl₂、11.5 mM葡萄糖和2.5 mM CaCl₂的Krebs-Ringer碳酸氢盐（KRB）溶液。使用当天将KRB溶液置于冰上保存。
   注意：KRB溶液可在4 °C下保存最多一周，使用前应使用97% O₂ 和3% CO₂ 混合气体预通气至少10分钟。

2. 肾脏的振动切片

1. 使用钝头镊子轻轻夹住并从冰冻的KRB溶液中取出已准备好的肾脏。立即将肾脏放置在吸水纸上约2–4秒，以去除表面多余的水分。轻轻滚动肾脏，使实质组织的各个面均干燥，以确保肾脏能与振动切片机载物台实现最佳粘附。
   注意：由于肾盂位于肾脏内部，受到外层实质组织的保护，因此短暂的干燥过程不会对组织完整性造成不利影响。
2. 立即在振动切片机样品板底部涂上一层薄薄的氰基丙烯酸酯胶水（约1 cm²），然后用钝头镊子将肾脏（输尿管朝下）放置在涂有胶水的区域。用镊子的平边轻轻向下按压肾脏顶部约10–20秒，使胶水干燥。
   注意：为在该过程中稳定肾脏，可使用另一把镊子固定肾脏，使其保持直立直至胶水干燥。确保肾脏以直立状态牢固粘附于样品板上，以保证切片平直。为确认肾脏已成功粘附，可轻推肾脏侧面；若粘附成功，肾脏底部应牢固固定在样品板上。
3. 将样品板牢固固定在缓冲液槽底部。调节KRB溶液液面高度，使肾脏顶部完全浸没于溶液中。在切片过程中，随着振动切片机刀片逐渐深入缓冲液槽，需逐步移除部分KRB溶液，防止刀片夹持装置浸入液体中。
   注意：若在胶水未完全干燥前进行此步骤，胶水可能从底部上移至肾脏实质组织表面，导致切片不均。若发生此情况，应将肾脏从样品板上取下，并更换新的肾脏样本重新开始。
4. 进行自动振动切片时，设定振动切片机刀片切割循环的起始和终止位置。确认这些位置距离肾脏边缘约0.5–1 cm，以确保每次刀片前进时均能完整切过整个肾脏平面。
5. 准备一个多孔板（24孔或48孔），在各孔中加入KRB溶液，并将板置于冰上。
   注意：生成的各个切片应分别放入不同的孔中，以便追踪切片的深度位置。
6. 启动自动切割程序。在刀片首次通过时，确保刀片与肾脏最顶端接触。若未接触，应调整刀片的起始Z轴位置。
7. 使用镊子收集从肾脏上分离的切片，并立即将其转移至各独立孔中，记录切片的Z轴深度，以估算切片中皮质髓质交界区（PKJ）的大致位置。
   注意： 根据切割参数的不同，部分切片可能未能完全从组织块上分离。若出现此情况，可小心使用精细弹簧剪刀将切片从肾脏组织块上剪下。建议用户在切片悬浮于各孔中时，主动在光学显微镜下观察，以确保切割参数和组织定位处于最佳状态。含有PKJ的切片通常位于肾脏顶部下方约1000–1500 µm处。
8. 继续切片操作，直至PKJ区域变得更为明显。切片过程中的代表性结果可参见“代表性结果”部分的描述。
9. 此时应优化切片参数，确保切片能均匀且完整地从肾脏组织块上分离。同时，确保PKJ区域连续且无断裂，因为破裂的PKJ壁会因塌陷而无法对壁内细胞进行充分成像。若发现壁结构破裂，应降低切片速度、增加切片厚度，并持续在光学显微镜下观察切片，以精细调整切割参数。
10. 将切片保存在4°C的KRB溶液中，直至开始实验。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔培养板	ThermoFisher Scientific	142485	用于存放肾组织切片
48孔培养板	ThermoFisher Scientific	152640	用于存放肾组织切片
吸水纸	Fisher Scientific	06-666A	在涂抹胶水前用于干燥肾脏
氰基丙烯酸酯胶	Amazon	B001PILFVY	用于将肾脏固定在样品板上
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J	The Jackson Laboratory	13148	GCaMP3 小鼠
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J	The Jackson Laboratory	24105	GCaMP6f 小鼠
B6.FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J	The Jackson Laboratory	19079	smMHC-CRE 小鼠
C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J	The Jackson Laboratory	13148	PDGFRa-CRE 小鼠
细尖镊子	Fine Science Tools	11254-20	用于肾脏的精细解剖
吉列银蓝双面刀片	Amazon	B009XHQGYO	用于插入振动切片机的刀片夹持器
学生型阿登镊	Fine Science Tools	91106-12	用于轻柔夹持和移动肾脏
学生型杜蒙特镊	Fine Science Tools	91150-20	用作内部解剖镊
Vibrocheck	Leica	14048142075	可选组件，用于校准切割过程中的刀片运动
VT1200 S 振动式切片机	Leica	14912000001	本方案中使用配置1