膀胱肿瘤类器官模型：将膀胱类器官原位移植至受体小鼠膀胱的方法

摘要

来源：Kim, Y. 等. 小鼠膀胱肿瘤类器官的培养、操作及原位移植。 J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们描述了将培养的膀胱肿瘤类器官原位移植到小鼠膀胱中，以研究器官微环境对肿瘤发生发展的作用。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 膀胱肿瘤类器官的传代培养

注意：建议在膀胱肿瘤类器官直径达到100–150 µm时进行传代。

1. 在含有肿瘤类器官的24孔板的类器官培养基中加入500 µL胶原酶/分散酶。用移液器反复吹打基底膜基质和培养基。在37 °C孵育20分钟，然后将细胞收集至15 mL离心管中。
   注意：在显微镜下观察从基底膜基质中分离的类器官。如果类器官未从基底膜基质中脱离，可延长孵育时间或增加吹打次数。
2. 加入5 mL预热的DMEM，于4 °C以400 × g离心3分钟，并吸除上清液。
3. 用1 mL预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA和10 µM Y-27632重悬沉淀。在37 °C水浴中孵育5分钟。剧烈吹打细胞数次，然后加入5 mL含10%胎牛血清（FBS）的DMEM以中和胰蛋白酶。
4. 于4 °C以400 × g离心3分钟，并吸除上清液。
5. 用1 mL预热的类器官培养基重悬沉淀，并计数单个肿瘤细胞的数量。

2. 膀胱类器官的原位移植（图1A）

1. 准备膀胱肿瘤类器官用于原位移植
   1. 移植前，按照上述方法将膀胱肿瘤类器官培养 5–7 天。
   2. 在含有肿瘤类器官的 24 孔板中加入 500 µL 胶原酶/分散酶溶液，反复吹打基底膜基质和培养基。于 37 °C 孵育 20 分钟，将细胞收集至 15 mL 离心管中。
   3. 加入 5 mL 预热的 DMEM 培养基，于 4 °C 以 400 × g 离心 3 分钟，吸除上清液。
   4. 用 1 mL DMEM 重悬沉淀，将悬液转移至 90 mm 培养皿中。
   5. 在显微镜下，使用 P200 微量移液器挑取 10–100 个肿瘤类器官，收集至预冷的微量离心管中。
   6. 于 4 °C 以 400 × g 离心 3 分钟，小心弃去上清液。
   7. 将细胞沉淀置于冰上保存，直至小鼠准备就绪进行手术。
2. 膀胱壁黏膜下移植
   1. 实验前至少 1 周准备 8 至 10 周龄的雄性裸鼠（CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl），使其适应新环境。术前 24 小时皮下注射恩诺沙星（5 mg/kg）。
   2. 用肥皂和水清洁操作台面。手术前对所有手术器械进行高压灭菌，并在无菌条件下使用无菌器械进行操作。
   3. 将 29 G 胰岛素注射器、移液器吸头和基底膜基质置于冰上。麻醉前皮下注射酮洛芬（5 mg/kg）。
   4. 在诱导舱中使用 4% 异氟烷麻醉小鼠。达到全身麻醉后，将小鼠仰卧位固定，并通过面罩吸入 2% 气化异氟烷维持麻醉。
      注意：若麻醉时间超过 30 分钟，需使用棉签将眼膏涂抹于双眼，防止角膜干燥。
   5. 使用无菌纱布蘸取聚维酮碘消毒，再用 70% 乙醇擦拭。每次更换新的纱布或棉签，重复此步骤 3 次。
   6. 使用一次性无菌手术巾覆盖肛门及手术区域。
   7. 在解剖显微镜下放大视野，使用无菌手术剪在下腹正中腹壁皮肤和肌层做一小的横向切口（小于 1.5 cm）。将膀胱从腹腔中暴露，并用生理盐水浸湿的棉签支撑。
      注意：若膀胱充满尿液，可轻压膀胱以适度减压。
   8. 将类器官沉淀重悬于 80 µL 含 50% 高浓度基底膜基质的类器官培养基中（表 1 和 材料表）。
   9. 在解剖显微镜下，使用 29 G 胰岛素注射器将类器官悬液注射至膀胱顶部前侧。
   10. 使用抗菌可吸收缝线缝合腹壁内层，再用 4-0 尼龙缝线缝合外层。用聚维酮碘和 70% 乙醇对术区进行消毒。
   11. 术后将小鼠置于红外线照射器下恢复 10–15 分钟。持续监测直至其恢复意识和自主活动能力。
   12. 术后第一天检查小鼠的一般状况及吻合口有无渗漏。术后连续 3 天每日皮下注射酮洛芬（5 mg/kg），术后连续 10 天每日皮下注射恩诺沙星（5 mg/kg）。
   13. 当切口愈合后（术后 10–14 天），拆除缝线。在类器官注射后 2–3 周内监测小鼠膀胱肿瘤的生长情况。
   14. 若观察到膀胱肿瘤生长，采用二氧化碳吸入法处死小鼠，并完整取出膀胱肿瘤组织。用冷 DPBS 冲洗组织（图 1B）。
   15. 为分析膀胱肿瘤组织学特征，对石蜡包埋组织切片进行苏木精-伊红（H&E）染色（图 1B）。

小鼠膀胱肿瘤类器官培养基
高级DMEM/F-12（基础培养基）	10 mM HEPES（pH 7.4）
10 mM 烟酰胺	0.5x 无血清添加剂
2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽	1% 青霉素/链霉素
1 mM N-乙酰-L-半胱氨酸	50 ng/mL 小鼠表皮生长因子
1 µM A 83-01

表1：膀胱肿瘤类器官培养基的成分。

结果

图 1：膀胱肿瘤类器官的原位移植。（A）膀胱肿瘤类器官原位移植至裸鼠的示意图。（B）接受膀胱肿瘤类器官原位移植的小鼠膀胱及其H&E染色切片的代表性图像。中间图中框选区域的放大视图显示在左侧图中。比例尺 = 500 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 锥形管	 SPL	 50015
24 孔板	 Corning	 3526
29 G 1/2 胰岛素注射器	 SHINA	 B299473538
50 mL 锥形管	 SPL	 50050
A8301	 Tocris	 2939	 储存浓度：25 mM
无水乙醇	 Daejung	 4023-2304
可吸收缝合线	 Henry Schein	 039010
高级 DMEM/F-12	 Thermo	 12634028
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl（裸鼠）	 Charles River	 194
I 型胶原酶	 Thermo	 17100017	 储存浓度：20 mg/mL
II 型胶原酶	 Thermo	 17100015	 储存浓度：20 mg/mL
胶原酶/分散酶	 Sigma	 10269638001	 储存浓度：1 mg/mL
DMEM（Dulbecco 改良最低必需培养基）	 Gibco	 11965-118
DMSO（二甲基亚砜）	 Sigma	 D8418
DPBS（Dulbecco 磷酸盐缓冲液）	 Welgene	 LB 001-02
生长因子减少型 Matrigel（GFR）	 Corning	 354230	 用于板中类器官培养
高浓度 Matrigel（HC）	 Corning	 354248	 用于类器官移植
1.5 mL 微量离心管	 Axygen	 MCT-150-C
剃须刀片
生理缓冲液	 JW Pharmaceutical
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	 Gibco	 25200072
超速离心管	 Beckman Coulter	 331372
Y-27632 二盐酸盐	 Abmole	 M1817	 储存浓度：10 mM