固相微萃取采样：一种用于移植物组织样本提取的探针式技术

摘要

来源：Stryjak, I. 等 利用化学活检进行移植物质量评估。J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们演示了使用固相微萃取探针从已获取的供体肾脏中提取代谢物的方法。所提取的代谢物可用于进行代谢组学和脂质组学分析，以评估器官移植的质量。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 探针的制备

1. 准备钛镍合金探针（40 mm 长度；0.2 mm 直径），表面涂覆 7 mm 混合模式吸附剂。探针数量取决于整个实验过程中设定的时间点以及重复次数（建议每个时间点设置 3 次重复）。
   注意：提取相的长度和类型可根据研究模式、代谢物的极性以及样品基质进行调整。
2. 配制清洗液，由氯仿:甲醇（2:1，v/v）组成。将 1.0 mL 该溶液移入每个 2.0 mL 玻璃小瓶中，并将已预先穿刺瓶盖的探针各放入一个小瓶中。
   注意：使用前需清洗所有探针，以去除可能存在的污染物颗粒。
3. 将小瓶置于振荡器上，设置振荡速度为 1,200 rpm。45 分钟后停止设备，并用液相色谱-质谱级水冲洗探针涂层。
4. 由于涂层需经过预平衡步骤以实现活化，因此配制预平衡溶液，由甲醇:水（1:1，v/v）组成。将 1.0 mL 该溶液移入每个 2.0 mL 玻璃小瓶中，并将已预先穿刺瓶盖的探针各放入一个小瓶中。
5. 将小瓶置于涡旋振荡器上，设置振荡速度为 1,200 rpm。
6. 60 分钟后，停止振荡器，并用液相色谱-质谱级水冲洗探针涂层。
7. 按照标准外科器械灭菌程序对探针进行灭菌处理。

2. 提取

1. 采样前立即打开无菌包装，以确保无菌环境。
2. 在每个时间点，将两根探针直接插入肾皮质，持续 10 分钟。探针涂层的整个长度必须被组织基质完全覆盖；无需特定角度，但通常采用约 90 度角。
   注意：整个医疗操作遵循所在机构的标准操作规程。不涉及对 SPME 采样的任何修改。该操作包括以下六个采样时间点：a) 肾脏切除前，来自供体的体内采样；b)–e) 肾脏灌注后 1 h、3 h、5 h、7 h，在器官腔室中进行的离体采样；f) 再灌注后，来自受体的体内采样。
3. 将探针从组织中抽出后收回，并立即用液相色谱-质谱级水冲洗涂层，以清除涂层表面残留的血液。冲洗操作应远离手术区域，并在探针取出后立即进行。

3. 运输与储存

1. 将探针分别放入不同的小瓶中并盖紧。
2. 将小瓶置于装有干冰或液氮的泡沫塑料盒中进行运输。
3. 将样品储存在超低温冰箱（-80 °C）中，或立即开始解吸步骤。

4. 解吸

1. 为代谢组学分析配制由80:20乙腈:水（v/v）组成的洗脱溶液，为脂质组学分析配制1:1异丙醇:甲醇（v/v）的洗脱溶液。
2. 将100 μL上述溶液移入置于已标记的2.0 mL小瓶中的插入件内，并将一根预先穿过瓶盖的探针放入每个小瓶中。
3. 将小瓶置于涡旋振荡器上，设置振荡速度为1,200 rpm，振荡120分钟。
4. 从小瓶中取出探针，所得提取物即可用于仪器分析。

5. 液相色谱-质谱分析

1. 将含有提取物的样品瓶放入LC-MS系统的自动进样器中。
   注意：本研究采用与高分辨质谱联用的液相色谱（反相色谱RP、亲水相互作用色谱HILIC）以及轨道阱（orbitrap）质谱分析仪。代谢组学分析参数请参见步骤5.2，脂质组学分析参数请参见步骤5.6。
2. 使用五氟苯基（PFP）色谱柱（2.1 mm × 100 mm，3 μm）进行反相分离。
   1. 设置流速为300 µL/min，自动进样器温度为4 °C，柱温为25 °C。
   2. 按以下比例配制流动相：流动相A：水:甲酸（99.9:0.1, v/v）；流动相B：乙腈:甲酸（99.9:0.1, v/v）。流动相梯度设置如下：0–3 min为100% A，3–25 min线性梯度变化至10% A，25–34 min保持10% A等度洗脱，随后进行6 min的色谱柱再平衡。
3. 进行HILIC分离时，使用HILIC色谱柱（2.0 mm × 100 mm，3 μm，200A），流速设为400 μL/min。
   1. 按以下比例配制流动相：流动相A：乙腈:醋酸铵缓冲液（9:1, v/v，有效盐浓度20 mM）；流动相B：乙腈:醋酸铵缓冲液（1:1, v/v，有效盐浓度20 mM）。
   2. 流动相梯度设置如下：0–3 min为100% A，保持3.0 min后在5 min内线性升至100% B，12 min前保持100% B，随后进行8 min的色谱柱再平衡。
4. 设置扫描范围为85–1000 m/z。在正离子化模式下，设定HESI离子源参数如下：喷雾电压1,500 V，毛细管温度300 °C，鞘气40 a.u.，辅助气流速15 a.u.，探针加热器温度300 °C，S-透镜射频水平55%。
5. 每分析10–12个样品后，运行一次质控（QC）样品（由每个分析样品各取10 µL混合而成），以监测仪器性能。
6. 进行反相分离时，使用C18色谱柱（2.1 mm × 75 mm，3.5 μm）。
   1. 设置流速为200 µL/min，自动进样器温度为4 °C，柱温为55 °C。按以下比例配制流动相：流动相A：H₂O:MeOH（60:40, v/v），含10 mM醋酸铵和1 mM乙酸；流动相B：IPA:MeOH（90:10, v/v），含10 mM醋酸铵和1 mM乙酸。
   2. 流动相梯度设置如下：0–1 min（20% B），1–1.5 min（20–50% B），1.5–7.5 min（50–70% B），7.5–13 min（70–95% B），13–17 min（95% B），17–17.1 min（95–20% B），17.1–23 min（20% B）。
7. 进行HILIC分离时，使用HILIC色谱柱（100 × 2.1 mm，3 μm）。
   1. 设置流速为400 µL/min，自动进样器温度为4 °C，柱温为40 °C。
   2. 按以下比例配制流动相：流动相A：ACN；流动相B：含5 mM醋酸铵的水溶液。流动相梯度设置如下：0–2 min（96% B），2–15 min（96–80% B），15–15.1 min（80–96% B），15.1–21 min（96% B）。
8. 在正离子化模式下，设定HESI离子源参数如下：喷雾电压3,500 V，毛细管温度275 °C，鞘气20 a.u.，辅助气流速10 a.u.，探针加热器温度300 °C，S-透镜射频水平55%。
9. 每分析10–12个样品后，运行一次质控（QC）样品（由每个分析样品各取10 µL混合而成），以监测仪器性能。
10. 使用与仪器兼容的软件进行数据采集。

6. 数据分析

1. 使用专用于非靶向代谢组学和脂质组学分析的软件进行数据处理、初步鉴定和统计分析。
   注意：可通过主成分分析（PCA）和箱线图来可视化数据结构。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸	Merck	5330010050	流动相添加剂
乙腈	Alchem	696-34967-4X2.5L	HPLC溶剂
乙酸铵	Merck	5330040050	流动相添加剂
BENCHMIXER XL MULTI-TUBE VORTEXER	Benchmark Scientific	BV1010	涡旋混合器
瓶盖	Perlan Technologies	5183-2076	蓝色螺口盖，预切PTFE/硅胶垫片，100个/包
氯仿	Merck	1024441000
Discovery HS F5 Supelguard 保护柱，3 μm，L × I.D. 2 cm × 2.1 mm	Merck	567570-U	HPLC保护柱
Discovery HS F5，2.1 mm x 100 mm，3 μm	Merck	567502-U	HPLC色谱柱
甲酸	Alchem	497-94318-50ML	流动相添加剂
玻璃小瓶	Perlan Technologies	5182-0714
HILIC Luna 3 μm，200A，100 x 2.0 mm	Shim-Pol	PHX-00D-4449-B0	HPLC色谱柱
HILIC SecurityGuard 保护柱，3 μm，4 x 2.0 mm	Shim-Pol	PHX-AJ0-8328	HPLC保护柱
异丙醇	Alchem	231-AL03262500	HPLC溶剂
甲醇	Alchem	696-34966-4X2.5L	HPLC溶剂
纳米纯水	Merck	1037281002	HPLC溶剂
Q Exactive Focus 混合四极杆-Orbitrap 质谱仪	Thermo Scientific	Q Exactive Focus	质谱仪
SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm	Merck	1506570001	HPLC色谱柱
SeQuant ZIC-HILIC 保护柱套件 20 x 2.1 mm	Merck	1504360001	HPLC保护柱
SPME LC 纤维探针，混合模式	Supelco	prototype fibers
UltiMate 3000 HPLC 系统	Thermo Scientific	UltiMate 3000	HPLC系统
小瓶内插管（去活化）	Perlan Technologies	5181-8872
XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm	Waters	186005644	HPLC色谱柱
XSelect CSH C18 VanGuard 保护柱 3.5μm, 2.1x5mm	Waters	186007811	HPLC保护柱