细胞外DNA染色：一种用于鉴定福尔马林固定石蜡包埋组织切片中细胞外DNA的方法

摘要

来源：O'Sullivan, K. M. 等. 监督式机器学习用于肾小球肾炎中细胞外DNA的半定量分析。J. Vis. Exp. (2020)

本视频介绍了对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片中细胞外DNA进行染色的技术。通过对染色的细胞外DNA进行定量，可评估任何导致癌细胞死亡的治疗手段的有效性。

方案

1. 使用 DAPI 和 β-肌动蛋白对 ecDNA 进行染色

1. 将载玻片放入载玻片架中，置于60 °C的烘箱内60分钟。
2. 在通风橱中，将载玻片浸入两种更换的溶剂（二甲苯或替代品）中，每次40分钟。
3. 将载玻片在100%乙醇、100%乙醇和70%乙醇中各浸泡5分钟进行复水处理。然后在自来水下洗涤5分钟。
4. 将加热板置于通风橱中，并在压力锅中预煮抗原修复液（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 9.0）。一旦抗原修复液开始沸腾，立即用镊子将载玻片水平放入锅中，并锁紧盖子。高温加热10分钟（相当于15 psi或103 kPa）。
   注意：此步骤至关重要，通过解除福尔马林固定引起的抗原表位交联，暴露目标抗原表位，从而实现抗体与表位的特异性结合；若省略此步，后续染色将无法进行。
5. 将压力锅从热源移开，并立即在水槽中用冷水冲淋锅盖顶部以打开盖子。让载玻片在抗原修复液中平衡20分钟。
6. 在摇床上用0.01 M磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤载玻片两次，每次5分钟。
7. 使用疏水性笔在肾组织周围画圈，注意在此过程中避免任何组织干燥。
8. 用含10%鸡血清的5%牛血清白蛋白（BSA）/PBS（pH 7.4，0.01 M）对组织进行封闭处理，每张切片加60 µL，孵育30分钟。此步骤后无需洗涤，使用60 µL移液器小心吸除封闭液，注意切勿使切片干燥。
9. 加入β-actin一抗混合液，按1/1000比例稀释于1% BSA/PBS（pH 7.4，0.01 M）中，每张切片加60 µL，在4 °C湿盒中过夜孵育。
10. 在摇床上用PBS（pH 7.4，0.01 M）洗涤载玻片两次，每次5分钟。
11. 加入二抗——鸡抗兔488（1/200稀释），每张切片加60 µL，溶于1% BSA/PBS（pH 7.4，0.01 M）中，室温孵育40分钟。
12. 在摇床上用PBS（pH 7.4，0.01 M）洗涤载玻片两次，每次5分钟。
13. 将载玻片浸入含0.3%苏丹黑的70%乙醇溶液中30分钟（置于Coplin染色缸中）。
    注意：此步骤非常重要，可淬灭由福尔马林固定引起的自发荧光。
14. 用自来水冲洗载玻片以去除沉淀物，随后浸入PBS（pH 7.4，0.01 M）中10分钟，防止进一步形成苏丹黑沉淀。
15. 使用含DAPI的封片剂，分三滴（每滴60 µL）将载玻片封固于共聚焦玻璃盖玻片上，并在盖玻片边缘涂抹指甲油密封。
16. 在室温下静置24小时使载玻片固化（以允许DAPI充分渗透），随后置于4 °C避光保存。
    注意：必须避光保存，以防止荧光探针褪色。
17. 使用连接于显微镜的共聚焦激光扫描头对载玻片进行成像。采用405 nm激光激发DAPI，488 nm激光激发Beta Actin。通过逐线扫描及4线平均模式采集单层1024 × 1024像素图像，这对检测ecDNA至关重要。使用40倍油镜（数值孔径1.0）。
    1. 每份样本至少成像20个肾小球。将图像保存为ND2文件格式。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白	SIGMA	A2153	用 PBS 配制 5% 和 1% 溶液，可批量配制后冷冻保存——解冻后即弃用
鸡抗山羊 IgG（H+L）交叉吸附抗体 Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-21468	使用前在小型离心机中离心 1 分钟，以避免抗体混合液中存在游离偶联物
鸡抗小鼠 IgG（H+L）交叉吸附抗体 Alex Fluor 647	ThermoFisher Scientific	A-121468	使用前在小型离心机中离心 1 分钟，以避免抗体混合液中存在游离偶联物
鸡抗兔 IgG（H+L）交叉吸附抗体 Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-21441	使用前在小型离心机中离心 1 分钟，以避免抗体混合液中存在游离偶联物
鸡血清	SIGMA	C5405	用 1% BSA/PBS 配制
盖玻片 24×60 mm	Azerscientific	ES0107222	#1.5，此为非标准厚度，专为共聚焦显微镜设计
EDTA 10 mM	SIGMA	E6758	将 TRIS 与 EDTA 溶于蒸馏水中，调 pH 至 9，用于抗原修复，可配制成 10 倍浓度溶液
乙醇 30%、70% 和 100%	Chem Supply	UN1170	以 100% 未变性乙醇形式提供——使用蒸馏水稀释至 30% 和 70%
甲醛 4%（10% 中性缓冲福尔马林）	TRAJAN	NBF-500	将肾脏组织放入含 3 ml 福尔马林的 5 ml 管中，室温固定 16 小时，福尔马林应在通风橱中使用
组织学载玻片 - 超级防脱，Menzel Glaze，25×75×1.0 mm	TRAJAN	J3800AM4	必须使用带正电荷涂层的载玻片。不推荐使用多聚-L-赖氨酸包被载玻片，因为在抗原修复步骤中组织易从载玻片脱落
山羊抗人/小鼠 MPO 抗体	R&D	AF3667	收到后分装并保存于 -80°C
疏水笔	VECTOR Labs	H-400	用于在肾脏组织周围画圈
磷酸盐缓冲液	SIGMA	P38135	0.01 M PB/0.09% NaCl，每次配制 5 L
6 L Tefal Secure 5 Neo 不锈钢压力锅	Tefal	GSA-P2530738	在当地家居用品商店购买
Prolong Gold DAPI	Life Technologies	P36962	直接滴加到盖玻片上
兔抗人/小鼠 Beta Actin 抗体	ABCAM	ab8227	收到后分装并保存于 -80°C
兔抗人/小鼠 H3Cit 抗体	ABCAM	ab5103	收到后分装并保存于 -80°C
24 片染色架	ProScitech	H4465	所选染色架必须能够耐受加压煮沸及在 60°C 烤箱中孵育
苏丹黑 B	SIGMA	199664	0.3%，将 3 g 加入 1 L 瓶中，溶于 70% 乙醇，过滤后避光保存——室温下可稳定保存 6 个月
Tris 10 mM	SIGMA	T4661	将 TRIS 与 EDTA 溶于蒸馏水中，调 pH 至 9，用于抗原修复，可配制成 10 倍浓度溶液
二甲苯	Trajan	XL005/20	必须在通风橱中使用