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从诱导性多能干细胞衍生人类肾脏足细胞：一种从干细胞定向分化成熟肾脏足细胞的实验方案 关键词：诱导性多能干细胞，肾脏足细胞，定向分化，干细胞分化，肾小球，足细胞标志物，PAX2，WT1，NEPHRIN，SYNPO，细胞培养，肾脏发育

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2023年4月30日

本文内容

摘要

来源：Burt, M. 等. 在化学成分明确条件下诱导人诱导多能干细胞定向分化为成熟肾小球足细胞。J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们介绍了通过在特定化学条件下诱导细胞分化，从诱导性多能干细胞中获得人类肾脏足细胞的实验方案。所获得的足细胞可用于肾毒性测试和疾病模型研究。

方案

1. 试剂的准备

  1. 将解冻的5x hiPS细胞培养基（CCM）添加剂与hiPS细胞培养基础培养基混合，稀释配制为1x hiPS CCM溶液。
    注意：冷冻的5x hiPS CCM添加剂需缓慢解冻，建议在4 ˚C过夜解冻。1x hiPS CCM可分装后于-20 ˚C保存，最长可达6个月。
  2. hiPS细胞培养用基底膜（BM）基质1包被板的制备：将BM基质1在4 ˚C冰上过夜解冻。解冻后，按照生产商建议的稀释比例进行分装。
    注意：通常将分装后的BM基质1在50 mL锥形管中用25 mL冷DMEM/F12稀释，充分混匀以完全溶解BM基质1，避免残留晶体形成。
  3. 将1 mL BM基质1溶液加入6孔板的每个孔中，于37 ˚C孵育1–2小时，或于4 ˚C孵育至少24小时，并用封口膜包裹。BM基质1包被板可在4 ˚C保存最长2周。
  4. 基底膜（BM）基质2包被板的制备：将适量BM基质2加入9 mL无菌蒸馏水中稀释，配制成终浓度为5 µg/mL的溶液。向12孔板的每孔中加入700 µL BM基质2溶液，在室温孵育2小时，或在4 ˚C过夜孵育。
  5. 分别配制BMP7、Activin A和VEGF的100 µg/mL储存液：将BMP7用含0.1%（wt/vol）BSA的无菌蒸馏水重悬，将Activin A和VEGF分别用含0.1%（wt/vol）BSA的无菌PBS重悬。为避免反复冻融，将每种储存液分装为100 µL，于-20 ˚C保存，最长可达6个月。
  6. 将10 mg Y27632溶解于3.079 mL无菌蒸馏水中，配制成10 mM储存液。分装100 µL至小管中，于-20 ˚C保存，最长可达6个月。
  7. 将2 mg CHIR99021溶解于143.4 µL无菌DMSO中，配制成30 mM储存液。分装为5 µL每管，于-20 ˚C保存，最长1个月（或根据生产商建议）。
  8. 将10 mg全-trans 维甲酸溶解于3.33 mL无菌DMSO中。分装为500 µL每管，于-20 ˚C保存，最长可达6个月。

2. 培养基的制备

  1. 通过将相应的储备液重新配制，制备中胚层分化培养基，终浓度为100 ng/mL Activin A、3 µM CHIR99021、10 µM Y27632，并在适量含谷氨酰胺补充剂的DMEM/F12培养基中加入1× B27无血清添加剂。
    注意：中胚层分化培养基应在分化步骤前新鲜配制，并根据实验规模配制适当体积（通常，50 mL培养基足以用于两块12孔板）。
  2. 通过将相应的储备液重新配制，制备中间中胚层分化培养基，终浓度为100 ng/mL BMP7、3 µM CHIR99021，并在含谷氨酰胺补充剂的DMEM/F12培养基中加入1× B27无血清添加剂。
    注意：如有需要，可在培养基中添加1%（体积比）青霉素-链霉素。使用含谷氨酰胺补充剂的DMEM/F12调节培养基体积。该培养基可大量配制，但建议分装成小份（例如，每50 mL锥形管中分装45 mL），以避免反复冻融。此培养基可在-20 ˚C保存长达3个月，使用前可在4 ˚C过夜解冻。
  3. 通过将相应的储备液重新配制，制备足细胞诱导培养基，终浓度为100 ng/mL BMP7、100 ng/mL activin A、50 ng/mL VEGF、3 µM CHIR99021、1× B27无血清添加剂以及0.1 µM全反式维甲酸，溶于含谷氨酰胺补充剂的DMEM/F12培养基中。避光保存培养基（例如，用铝箔纸包裹容器）。
    注意：该培养基可大量配制，并在-20 ˚C避光保存长达3个月。冷冻分装样品使用前应在4 ˚C过夜解冻。
  4. 通过在DMEM/F12培养基中加入10%（体积比）热灭活FBS，制备25 mL胰酶中和溶液，并在无菌条件下过滤。
  5. 为维持干细胞来源的足细胞在分化后的生长，按照生产商说明书将补充剂加入基础培养基中，配制含足细胞维持添加剂的完全培养基，并在4 ˚C保存最多两周。

3. 使用 hiPS 细胞培养基进行无饲养层 hiPS 细胞培养

  1. 吸去预包被板中 BM 基质 1 的残余溶液，用 1 至 2 mL 温热的 DMEM/F12 洗涤孔板 3 次 。
  2. 吸去 hiPS 细胞的用后 hiPS CCM，用温热的 DMEM/F12 将细胞洗涤 3 次 。加入 1 mL 温热的细胞解离溶液，在 37 ˚C 下孵育 1 分钟以促进细胞解离。在组织培养显微镜下进行细胞形态观察，确保细胞集落边缘呈圆形，然后迅速吸去细胞解离溶液（确保细胞集落仍附着于培养板上，尽管结合较松）。用 DMEM/F12 轻柔冲洗细胞一次，以去除残留的细胞解离溶液。
  3. 向经细胞解离溶液处理的 hiPS 细胞（每孔 6 孔板）中加入 3 mL hiPS CCM。使用细胞刮刀刮下细胞集落，并轻轻吹打细胞悬液以使松散附着的细胞脱落。充分冲洗培养板，确保所有细胞均被收集。
    注意：建议使用 5 mL 移液管，以避免对细胞造成过大的剪切力。
  4. 将 0.5 mL 细胞悬液转移至新的 BM 基质 1 包被的 6 孔板中，每孔预先加入 2 mL hiPS CCM。以“8”字形方式轻柔晃动培养板，使细胞集落在孔内均匀分布，并在 37 ˚C、5 % CO2 的培养箱中孵育。每日更换培养基，直至细胞达到传代或用于分化实验的合适状态（约 70 % 汇合度）。
    注意：在无饲养层条件下使用 hiPS CCM（不含 ROCK 抑制剂）进行常规传代时，理想的细胞集落大小为 200–500 µm。若在解离酶或缓冲液处理过程中细胞被单细胞化，可在 hiPS CCM 中添加 ROCK 抑制剂（例如 10 µM Y27632）以提高细胞存活率。

4. 将hiPS细胞分化为中胚层细胞（第0–2天）

  1. 在 hiPS 细胞培养处于对数生长期时（传代后约 4 天内，细胞融合度约为 70%），需肉眼观察集落内部及边缘是否存在自发分化的细胞。如有必要，需在无菌条件下刮除分化区域。
  2. 吸除 hiPS 细胞的 hiPS CCM 培养基，用预热的 DMEM/F12 培养基清洗细胞 3 次 。加入 1 mL 无酶细胞解离缓冲液，在 37 ˚C 下孵育 10 分钟，并在显微镜下检查细胞解离情况。由于不同 hiPS 细胞系之间存在固有差异，具体细胞解离缓冲液的孵育时间需根据特定细胞系进行优化确定。
  3. 使用细胞刮轻轻刮取培养孔，使松散贴壁的细胞脱落，将细胞悬液转移至 15 mL 圆底离心管中，随后用移液器反复吹打数次，使 hiPS 细胞充分分散成单细胞悬液。
    1. 用预热的 DMEM/F12 培养基将细胞悬液补至 15 mL，室温下以 290 x g 离心 5 分钟。
    2. 轻柔吸除上清液，用预热的 DMEM/F12 培养基重悬细胞，进行第二轮离心，以彻底去除残留的 BM 基质 1 和解离缓冲液成分。
  4. 吸除上清液，将细胞重悬于 1 mL 上述所述的中胚层诱导培养基中。使用血细胞计数板或库尔特计数器对细胞总数进行计数，以确定所需中胚层分化培养基的体积，使细胞浓度达到 1 × 105 个细胞/mL。
  5. 吸除 BM 基质 2 包被板中的 ECM 溶液，用预热的 DMEM/F12 培养基清洗培养板两次。通过轻微吹打使 hiPS 细胞悬液混匀，将 1 mL 细胞悬液转移至每孔 BM 基质 2 包被的 12 孔板中，随后轻轻振荡培养板，使细胞分布更均匀。
  6. 将培养板置于 37 ˚C、5% CO2 的培养箱中孵育。次日更换新鲜的中胚层诱导培养基。
    注意：培养 2 天后，hiPS 细胞来源的中胚层细胞即可用于中间中胚层诱导。

5. 将hiPS细胞来源的中胚层细胞分化为中间中胚层（第2–16天）

  1. 在分化方案的第2天，吸除中胚层诱导培养基，并每孔补充1 mL中间中胚层诱导培养基。
  2. 每天更换培养基，以维持代谢活跃细胞所需的生长因子和小分子的精确浓度阈值。如果细胞生长显著且培养基营养成分消耗迅速（表现为培养基变黄），可将12孔板每孔的中间中胚层分化培养基体积增加至1.3 mL。
  3. 继续培养细胞额外14天，以获得中间中胚层细胞。至第16天，这些细胞可进行冻存以备后续使用。

6. 将 hiPS 细胞来源的中间中胚层细胞分化为足细胞（第16–21天）

  1. 用预热的 DMEM/F12 洗涤中胚层细胞，随后每孔加入 0.5 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，在 37 ˚C 下孵育 3 分钟。进行显微镜观察，确保细胞开始解离。
  2. 使用细胞刮刀刮取细胞，并用 1,000 µL 移液枪头反复吹打细胞悬液，以获得单个细胞或少量小细胞团。
    注意： 此步骤需确保细胞完全解离，因为聚集的细胞可能无法在本实验方案规定的时间内获得终末分化表型。
  3. 每孔加入约 2 mL 胰蛋白酶中和液，以终止胰蛋白酶活性。
  4. 将细胞转移至 50 mL 锥形管中，并用 DMEM/F12 补充总体积至 50 mL，随后在室温下以 201 x g 离心 5 分钟。
  5. 吸除上清液，将细胞重悬于足细胞诱导培养基中。为获得最佳效果，确保最终接种密度约为每 12 孔板孔 100,000 个细胞。将细胞悬液加入已包被 BM 基质胶 2 的培养板中，并轻轻振荡培养板以使细胞分布更均匀。
  6. 将细胞置于 37 ˚C、5% CO2 条件下培养，每天更换培养基，持续最多 5 天，以在第 21 天获得足细胞。
    注意： 所得的人诱导多能干细胞来源的足细胞可在完全培养基与足细胞维持培养基中继续培养 2–4 周。一旦转入足细胞维持培养基，可每隔一天换液一次，并可用于后续实验或下游分析。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞
DU11 人源 iPS 细胞DU11（杜克大学克隆 #11）iPS 细胞系由杜克大学 iPSC 核心设施生成，并由杜克大学 Bursac 实验室提供给我们。该细胞系已进行支原体检测，且于 2019 年 7 月由我实验室完成最后一次核型分析，结果显示核型正常。
生长因子与培养基添加剂
全反式维甲酸（500 mg）72262Stem Cell Technologies
B27 无血清添加剂17504044Thermo/Life Technologies
CHIR9902104-0004Stemgent可能存在批间差异
含
CultureBoost-R 的完全培养基试剂盒		4Z0-500-RCell Systems足细胞维持培养基
DMEM/F1212634028Thermo/Life Technologies
含 GlutaMAX 添加剂的 DMEM/F1210565042Thermo/Life Technologies含谷氨酰胺添加剂的 DMEM/F12
热灭活 FBS10082147Thermo/Life Technologies
人源激活素 APHC9564Thermo/Life Technologies
人源 BMP7PHC9544Thermo/Life Technologies
人源 VEGFPHC9394Thermo/Life Technologies
mTeSR1 培养基05850Stem Cell Technologies人源 iPS 细胞培养基（CCM）
青霉素-链霉素溶液（100×）15140-163Thermo/Life Technologies
Y27632 ROCK 抑制剂1254Tocris
抗体
Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 594 标记的二抗A32744; A32754; A-11076; A32790Thermo/Life Technologies
Brachyury(T)ab20680Abcam
NephrinGP-N2Progen
OCT4AF1759R&D Systems
PAX271-6000Invitrogen
WT1MAB4234Millipore
细胞外基质分子
iMatrix-511 层粘连蛋白-E8（LM-E8）片段N-892012Iwai North America基底膜（BM）基质 2
适用于 hESC 的 Matrigel 基质，5 mL 瓶装354277BD Biosciences基底膜（BM）基质 1。可能存在批间差异
酶及其他试剂
AccutaseA1110501Thermo/Life Technologies细胞解离溶液
BSAA9418Sigma-Aldrich
二甲基亚砜（DMSO）D2438Sigma-AldrichDMSO 具有毒性，应在化学安全通风橱中操作
无酶细胞解离缓冲液，Hank’s 平衡盐溶液13150016Thermo/Life Technologies
乙醇溶液，70%（体积/体积），生物技术级97065-058VWR乙醇易燃且有毒
FBS431097Corning
多聚甲醛（PFA）28906Thermo/Life TechnologiesPFA 应在配备适当个人防护装备（包括手套、实验服和护目镜）的化学通风橱中操作。避免吸入及皮肤接触。
磷酸盐缓冲液（PBS）14190-250Thermo/Life Technologies
无菌蒸馏水15230162Thermo/Life Technologies
Triton X-10097062-208VWR
胰蛋白酶-EDTA（0.05%）25300-120Thermo/Life Technologies
设备
吸管，独立包装29442-462Corning
Avanti J-15R 离心机B99516Beckman Coulter
锥形离心管，15 mL352097Corning
锥形离心管，50 mL352098Corning
冻存盒3395465Thermo/Life Technologies用于储存冷冻分装样品
EVOS M7000AMF7000Thermo/Life Technologies荧光显微镜，用于获取固定并染色的 iPS 细胞及其分化产物的图像
血细胞计数板100503-092VWR
Heracell VIOS 160i CO2 培养箱51030403Thermo/Life Technologies用于 iPS 细胞及其分化产物的常规培养与维持
配备 AxioCam 503 相机的倒置 Zeiss Axio Observer 显微镜491916-0001-000（显微镜）;
426558-0000-000（相机）		Carl Zeiss Microscopy用于在足细胞分化的各个阶段获取活体 iPS 细胞及其分化产物的相差图像
Kimberly-Clark 丁腈手套40101-346VWR
Kimwipes，大号21905-049VWR
Kimwipes，小号21905-026VWR
P10 精密屏障移液器吸头P1096-FRDenville Scientific
P100 屏障移液器吸头P1125Denville Scientific
P1000 屏障移液器吸头P1126Denville Scientific
P20 屏障移液器吸头P1121Denville Scientific
P200 屏障移液器吸头P1122Denville Scientific
移液管，10 mL，独立包装356551Corning
移液管，25 mL，独立包装356525Corning
移液管，5 mL，独立包装356543Corning
Steriflip，0.22 μm，PESSCGP00525EMD Millipore
无菌微量离心管1138W14Thomas Scientific用于生长因子的分装
组织培养–处理的 12 孔板353043Corning
组织培养–处理的 6 孔板353046Corning
VWR 白色 techuni 实验服10141-342VWR
宽斜面细胞刮刀3008Corning

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