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方法文章

从诱导性多能干细胞衍生人类肾脏足细胞：一种从干细胞定向分化成熟肾脏足细胞的实验方案 关键词：诱导性多能干细胞，肾脏足细胞，定向分化，干细胞分化，肾小球，足细胞标志物，PAX2，WT1，NEPHRIN，SYNPO，细胞培养，肾脏发育

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2023年4月30日

本文内容

摘要

来源：Burt, M. 等. 在化学成分明确条件下诱导人诱导多能干细胞定向分化为成熟肾小球足细胞。J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们介绍了通过在特定化学条件下诱导细胞分化，从诱导性多能干细胞中获得人类肾脏足细胞的实验方案。所获得的足细胞可用于肾毒性测试和疾病模型研究。

方案

1. 试剂的准备

  1. 将解冻的5x hiPS细胞培养基（CCM）添加剂与hiPS细胞培养基础培养基混合，稀释配制为1x hiPS CCM溶液。
    注意：冷冻的5x hiPS CCM添加剂需缓慢解冻，建议在4 ˚C过夜解冻。1x hiPS CCM可分装后于-20 ˚C保存，最长可达6个月。
  2. hiPS细胞培养用基底膜（BM）基质1包被板的制备：将BM基质1在4 ˚C冰上过夜解冻。解冻后，按照生产商建议的稀释比例进行分装。
    注意：通常将分装后的BM基质1在50 mL锥形管中用25 mL冷DMEM/F12稀释，充分混匀以完全溶解BM基质1，避免残留晶体形成。
  3. 将1 mL BM基质1溶液加入6孔板的每个孔中，于37 ˚C孵育1–2小时，或于4 ˚C孵育至少24小时，并用封口膜包裹。BM基质1包被板可在4 ˚C保存最长2周。
  4. 基底膜（BM）基质2包被板的制备：将适量BM基质2加入9 mL无菌蒸馏水中稀释，配制成终浓度为5 µg/mL的溶液。向12孔板的每孔中加入700 µL BM基质2溶液，在室温孵育2小时，或在4 ˚C过夜孵育。
  5. 分别配制BMP7、Activin A和VEGF的100 µg/mL储存液：将BMP7用含0.1%（wt/vol）BSA的无菌蒸馏水重悬，将Activin A和VEGF分别用含0.1%（wt/....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞
DU11 人源 iPS 细胞DU11（杜克大学克隆 #11）iPS 细胞系由杜克大学 iPSC 核心设施生成，并由杜克大学 Bursac 实验室提供给我们。该细胞系已进行支原体检测，且于 2019 年 7 月由我实验室完成最后一次核型分析，结果显示核型正常。
生长因子与培养基添加剂
全反式维甲酸（500 mg）72262Stem Cell Technologies
B27 无血清添加剂17504044Thermo/Life Technologies
CHIR9902104-0004Stemgent可能存在批间差异
含
CultureBoost-R 的完全培养基试剂盒		4Z0-500-RCell Systems足细胞维持培养基
DMEM/F1212634028Thermo/Life Technologies
含 GlutaMAX 添加剂的 DMEM/F1210565042Thermo/Life Technologies含谷氨酰胺添加剂的 DMEM/F12
热灭活 FBS10082147Thermo/Life Technologies
人源激活素 APHC9564Thermo/Life Technologies
人源 BMP7PHC9544Thermo/Life Technologies
人源 VEGFPHC9394Thermo/Life Technologies
mTeSR1 培养基05850Stem Cell Technologies人源 iPS 细胞培养基（CCM）
青霉素-链霉素溶液（100×）15140-163Thermo/Life Technologies
Y27632 ROCK 抑制剂1254Tocris
抗体
Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 594 标记的二抗A32744; A32754; A-11076; A32790Thermo/Life Technologies
Brachyury(T)ab20680Abcam
NephrinGP-N2Progen
OCT4AF1759R&D Systems
PAX271-6000Invitrogen
WT1MAB4234Millipore
细胞外基质分子
iMatrix-511 层粘连蛋白-E8（LM-E8）片段N-892012Iwai North America基底膜（BM）基质 2
适用于 hESC 的 Matrigel 基质，5 mL 瓶装354277BD Biosciences基底膜（BM）基质 1。可能存在批间差异
酶及其他试剂
AccutaseA1110501Thermo/Life Technologies细胞解离溶液
BSAA9418Sigma-Aldrich
二甲基亚砜（DMSO）D2438Sigma-AldrichDMSO 具有毒性，应在化学安全通风橱中操作
无酶细胞解离缓冲液，Hank’s 平衡盐溶液13150016Thermo/Life Technologies
乙醇溶液，70%（体积/体积），生物技术级97065-058VWR乙醇易燃且有毒
FBS431097Corning
多聚甲醛（PFA）28906Thermo/Life TechnologiesPFA 应在配备适当个人防护装备（包括手套、实验服和护目镜）的化学通风橱中操作。避免吸入及皮肤接触。
磷酸盐缓冲液（PBS）14190-250Thermo/Life Technologies
无菌蒸馏水15230162Thermo/Life Technologies
Triton X-10097062-208VWR
胰蛋白酶-EDTA（0.05%）25300-120Thermo/Life Technologies
设备
吸管，独立包装29442-462Corning
Avanti J-15R 离心机B99516Beckman Coulter
锥形离心管，15 mL352097Corning
锥形离心管，50 mL352098Corning
冻存盒3395465Thermo/Life Technologies用于储存冷冻分装样品
EVOS M7000AMF7000Thermo/Life Technologies荧光显微镜，用于获取固定并染色的 iPS 细胞及其分化产物的图像
血细胞计数板100503-092VWR
Heracell VIOS 160i CO2 培养箱51030403Thermo/Life Technologies用于 iPS 细胞及其分化产物的常规培养与维持
配备 AxioCam 503 相机的倒置 Zeiss Axio Observer 显微镜491916-0001-000（显微镜）;
426558-0000-000（相机）		Carl Zeiss Microscopy用于在足细胞分化的各个阶段获取活体 iPS 细胞及其分化产物的相差图像
Kimberly-Clark 丁腈手套40101-346VWR
Kimwipes，大号21905-049VWR
Kimwipes，小号21905-026VWR
P10 精密屏障移液器吸头P1096-FRDenville Scientific
P100 屏障移液器吸头P1125Denville Scientific
P1000 屏障移液器吸头P1126Denville Scientific
P20 屏障移液器吸头P1121Denville Scientific
P200 屏障移液器吸头P1122Denville Scientific
移液管，10 mL，独立包装356551Corning
移液管，25 mL，独立包装356525Corning
移液管，5 mL，独立包装356543Corning
Steriflip，0.22 μm，PESSCGP00525EMD Millipore
无菌微量离心管1138W14Thomas Scientific用于生长因子的分装
组织培养–处理的 12 孔板353043Corning
组织培养–处理的 6 孔板353046Corning
VWR 白色 techuni 实验服10141-342VWR
宽斜面细胞刮刀3008Corning

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