膀胱逼尿肌平滑肌细胞分离：一种通过酶消化法从人膀胱组织标本中获取逼尿肌细胞的实验方案

摘要

来源：Malysz, J. 等. 利用新鲜分离的人膀胱逼尿肌平滑肌细胞表征对9-苯蒽酚敏感的阳离子电流的制备与应用。J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们演示了使用两步序贯酶消化法从人膀胱标本中分离逼尿肌平滑肌细胞。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. DSM 组织的解剖及无黏膜 DSM 组织块的制备

1. 检查从手术室送至实验室的全层膀胱标本，标本应置于装有冷解离/消化液的 tightly sealed 容器中（图1 和 表1 为解离液 DS 的成分）。
   注意： 标本通常在到达实验室前已在冷 DS 中保存数小时至过夜。若需更长时间保存，应在 DS （表1） 中添加 1 mM CaCl₂。
2. 用预冷的 DS 冲洗人全层膀胱逼尿肌（DSM）标本（包含黏膜层、逼尿肌层及浆膜层等所有层次），以去除附着的碎屑和血液。
3. 将膀胱标本平铺于涂有硅胶对映体（见材料表）的 150 mm 直径圆形培养皿中，黏膜面朝上，浆膜面朝下，并用冰冻 DS 浸没固定 （图1B）。
4. 使用显微剪刀和镊子进行锐性解剖，去除标本周围的脂肪组织、血管、上皮（尿路上皮）以及黏膜肌层。
5. 切取数块去除了黏膜的 DSM 组织片（长约 2–3 mm，宽约 4–6 mm）（图1C）。

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结果

图1： 分离步骤概述，用于制备逼尿肌平滑肌（DSM）组织块及酶解离所用装置。 显示的图像包括： （A） 来自开放性膀胱手术的全层人类膀胱标本，作为手术多余组织置于冰冻DS中提供， （B） 同一标本在用部分解剖的DSM层固定后 (C) 从脱细胞羊膜层切割出的不同尺寸的脱细胞羊膜片，可用于酶消化（较小片）或其他实验研究（较大片）， （D，E） 用于D.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5 ml 聚苯乙烯圆底试管	Falcon	352054	用于盛装消化步骤中所用酶的 DS 管
模拟旋涡混合器	VWR	58816-121
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7906	DS
氯化钙	Sigma-Aldrich	C1016	细胞外溶液和 DS
EGTA 	Sigma-Aldrich	E3889 	Ca2+ 螯合剂，用于细胞内移液管溶液
葡萄糖 	Sigma 	G8270
II 型胶原酶	Worthington Biochemical Corporation	LS004177	DS-C
氢氧化铯水合物 	Sigma-Aldrich	C8518 	细胞内移液管溶液
CsCl	Sigma-Aldrich	203025	细胞外和细胞内溶液
DL-二硫苏糖醇（DDT）	Sigma-Aldrich	D9779	与木瓜蛋白酶联合使用的还原剂
NaOH  	Sigma-Aldrich	S8045
硝苯地平 	Sigma-Aldrich	N7634	L 型电压门控 Ca2+ 通道阻滞剂
浮动泡沫试管架/支架	VWR Scientific	82017-634	用于固定盛有酶的试管以实现温度控制
谷氨酸钠盐	Sigma-Aldrich	G1626	DS
木瓜蛋白酶	Worthington Biochemical Corporation	LS003126	DS-P
MgCl2（六水合物）  	Sigma-Aldrich	M2670 	细胞外和细胞内溶液
KCl 	Fisher Scientific 	BP366-1 	细胞外溶液
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	细胞外和细胞内溶液
非金属注射器针头，MicroFil	WPI	MF-34G-5	用于填充细胞内移液管溶液
巴斯德吸管	FisherBrand	13-678-20A	吸管尖端被打断并火焰抛光，用于滴定经酶处理的组织，以从组织块中释放单个 DSM 细胞
HEPES 	Sigma-Aldrich	H3375 	pH 缓冲液
Thermo Scientific Precision 摇动水浴箱（型号 2870）	Thermo Scientific	已停产	用于控制酶消化过程的水浴装置，可作为组织浴槽循环水浴系统的替代方案
乙烯基管	ColePalmer	06405-3	多种用途，包括连接组织浴槽与循环水浴
水循环浴槽，Haake D1 L	Haake	已停产	连接至组织浴槽
配备 10x 和 40x 物镜的 ZeissAxiovert 40C 倒置显微镜	Carl-Zeiss	已停产	膜片钳装置系统的一部分