来源：Malysz, J. 等. 利用新鲜分离的人膀胱逼尿肌平滑肌细胞表征对9-苯蒽酚敏感的阳离子电流的制备与应用。J. Vis. Exp. (2020)
在本视频中，我们演示了使用两步序贯酶消化法从人膀胱标本中分离逼尿肌平滑肌细胞。
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方法文章
膀胱逼尿肌平滑肌细胞分离：一种通过酶消化法从人膀胱组织标本中获取逼尿肌细胞的实验方案
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2023年4月30日
本文内容
摘要
方案
所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。
1. DSM 组织的解剖及无黏膜 DSM 组织块的制备
- 检查从手术室送至实验室的全层膀胱标本，标本应置于装有冷解离/消化液的 tightly sealed 容器中（图1 和 表1 为解离液 DS 的成分）。
注意： 标本通常在到达实验室前已在冷 DS 中保存数小时至过夜。若需更长时间保存，应在 DS （表1） 中添加 1 mM CaCl2。 - 用预冷的 DS 冲洗人全层膀胱逼尿肌（DSM）标本（包含黏膜层、逼尿肌层及浆膜层等所有层次），以去除附着的碎屑和血液。
- 将膀胱标本平铺于涂有硅胶对映体（见材料表）的 150 mm 直径圆形培养皿中，黏膜面朝上，浆膜面朝下，并用冰冻 DS 浸没固定 （图1B）。
- 使用显微剪刀和镊子进行锐性解剖，去除标本周围的脂肪组织、血管、上皮（尿路上皮）以及黏膜肌层。
- 切取数块去除了黏膜的 DSM 组织片（长约 2–3 mm，宽约 4–6 mm）（图1C）。
2. 酶法解离 DSM 组织块以获得新鲜分离的单个 DSM 细胞
- 将3至6个DSM组织块放入含有1至2 mL预热（约37 °C）的含木瓜蛋白酶和二硫苏糖醇的DS溶液（DS-P，表1）的离心管中，在约37 °C条件下孵育30–45分钟，期间轻轻振荡管子（每10–15分钟一次）。
注意：为最佳控制酶解处理的温度，可将装有组织块和酶溶液的离心管置于连接循环加热水浴的玻璃组织培养室（图1D）中，或置于高精度温控振荡水浴箱（图1E）中。 - 移除离心管中的DS-P溶液，用冰冻的DS溶液短暂清洗DSM组织块，弃去冷DS溶液，保留DSM组织块沉于管底。
- 向含有DSM组织块的离心管中加入1至2 mL含II型胶原酶的DS溶液（DS-C，表1），轻轻混匀后在约37 °C孵育25–40分钟，期间轻轻振荡管子（每10–15分钟一次）。
- 弃去DS-C溶液，并用冰冻的DS溶液洗涤经酶处理的DSM组织块5–10次。
- 最后一次洗涤后，保留离心管内的DS溶液；用火焰抛光的巴斯德移液管轻轻吹打数次，以释放单个DSM细胞。
- 取数滴含有分散DSM细胞的DS溶液滴加至玻璃底培养皿或盖玻片上，至少静置5分钟使细胞贴附于底部后，在显微镜下（使用20x或40x物镜）观察细胞质量。
- 立即使用新鲜分离的DSM细胞进行电生理实验，或将其保存在含有DS溶液的离心管中，置于约4 °C（冰上或冰箱中）直至使用（通常在制备后8小时内使用）。
注意：同一批制备过程中，细胞质量可能从高度存活到过度消化、死亡的DSM细胞不等 （图2）。若连续使用木瓜蛋白酶-胶原酶法导致大量细胞不可存活，则应弃用该批次，并重新消化DSM组织块，但缩短孵育时间。若所得DSM细胞数量过少，则在后续消化中应延长孵育时间。α-平滑肌肌动蛋白免疫阳性染色可确认DSM细胞的身份 （图3）。
| 溶液类型 | 成分（单位：mM） |
| DS（解剖/消化液） | 80 Na-谷氨酸盐，55 NaCl，6 KCl，10 HEPES，2 MgCl2，以及11葡萄糖，用10 M NaOH调节pH至7.4 |
| 含木瓜蛋白酶的DS（DS-P） | 含1-2 mg/ml木瓜蛋白酶、1 mg/ml二硫苏糖醇和1 mg/ml牛血清白蛋白的DS溶液 |
| 含胶原酶的DS-C（DS-C, Collagenase-containing DS） | 含 1-2 mg/ml II 型胶原酶、1 mg/ml 牛血清白蛋白、0 或 1 mg/ml 胰蛋白酶抑制剂以及 100-200 μM Ca 的 DS 溶液2+ |
| P（移液器） | 110 CsOH，110 天冬氨酸，10 NaCl，1 MgCl2，10 HEPES，0.05 EGTA 和 30 CsCl，用 CsOH 调节 pH 至 7.2，并添加两性霉素-B（300–500 μg/ml） |
| E（细胞外） | 10 毫摩尔四乙基氯化铵（TEA）、6 毫摩尔氯化铯（CsCl）、124 毫摩尔氯化钠（NaCl）、1 毫摩尔氯化镁（MgCl）2，2 CaCl2，10 HEPES，10 葡萄糖，用 NaOH 或 CsOH 调节 pH 至 7.3–7.4，以及 0.002–3（2–3 mM）尼莫地平 |
表1：解剖/消化液（DS）以及穿孔膜片钳实验中所用移液管液和细胞外液的成分。
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结果
图1： 分离步骤概述，用于制备逼尿肌平滑肌（DSM）组织块及酶解离所用装置。 显示的图像包括： （A） 来自开放性膀胱手术的全层人类膀胱标本，作为手术多余组织置于冰冻DS中提供， （B） 同一标本在用部分解剖的DSM层固定后 (C) 从脱细胞羊膜层切割出的不同尺寸的脱细胞羊膜片，可用于酶消化（较小片）或其他实验研究（较大片）， （D，E） 用于D...
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5 ml 聚苯乙烯圆底试管 | Falcon | 352054 | 用于盛装消化步骤中所用酶的 DS 管 |
| 模拟旋涡混合器 | VWR | 58816-121 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A7906 | DS |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | C1016 | 细胞外溶液和 DS |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Ca2+ 螯合剂，用于细胞内移液管溶液 |
| 葡萄糖 | Sigma | G8270 | |
| II 型胶原酶 | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | DS-C |
| 氢氧化铯水合物 | Sigma-Aldrich | C8518 | 细胞内移液管溶液 |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 203025 | 细胞外和细胞内溶液 |
| DL-二硫苏糖醇（DDT） | Sigma-Aldrich | D9779 | 与木瓜蛋白酶联合使用的还原剂 |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 硝苯地平 | Sigma-Aldrich | N7634 | L 型电压门控 Ca2+ 通道阻滞剂 |
| 浮动泡沫试管架/支架 | VWR Scientific | 82017-634 | 用于固定盛有酶的试管以实现温度控制 |
| 谷氨酸钠盐 | Sigma-Aldrich | G1626 | DS |
| 木瓜蛋白酶 | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | DS-P |
| MgCl2（六水合物） | Sigma-Aldrich | M2670 | 细胞外和细胞内溶液 |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | 细胞外溶液 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | 细胞外和细胞内溶液 |
| 非金属注射器针头，MicroFil | WPI | MF-34G-5 | 用于填充细胞内移液管溶液 |
| 巴斯德吸管 | FisherBrand | 13-678-20A | 吸管尖端被打断并火焰抛光，用于滴定经酶处理的组织，以从组织块中释放单个 DSM 细胞 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | pH 缓冲液 |
| Thermo Scientific Precision 摇动水浴箱（型号 2870） | Thermo Scientific | 已停产 | 用于控制酶消化过程的水浴装置，可作为组织浴槽循环水浴系统的替代方案 |
| 乙烯基管 | ColePalmer | 06405-3 | 多种用途，包括连接组织浴槽与循环水浴 |
| 水循环浴槽，Haake D1 L | Haake | 已停产 | 连接至组织浴槽 |
| 配备 10x 和 40x 物镜的 ZeissAxiovert 40C 倒置显微镜 | Carl-Zeiss | 已停产 | 膜片钳装置系统的一部分 |
