来源：Malysz, J. 等. 利用新鲜分离的人膀胱逼尿肌平滑肌细胞表征9-苯并蒽酚敏感性阳离子电流的制备与应用。J. Vis. Exp. (2020)
本视频展示了利用两性霉素B介导的穿孔膜片钳技术，对逼尿肌平滑肌细胞中瞬时受体电位 melastatin 4 型（TRPM4）离子通道的阳离子电流进行表征的方法。该技术有助于评估离子通道的生物物理和药理学特性。
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方法文章
两性霉素B介导的穿孔膜片钳分析：一种用于研究膀胱尿路上皮细胞离子电流的电生理学技术
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2023年4月30日
本文内容
摘要
方案
1. 使用两性霉素B穿孔式全细胞膜片钳技术记录DSM细胞中电压阶跃诱导的阳离子电流
- 用移液器将 0.25–1 mL 细胞悬液滴加到倒置显微镜载物台上的玻璃底培养皿中，使细胞贴附于玻璃底部。
- 孵育至少 45 分钟后，通过灌流方式从浴槽中移除消化液（DS），并用 E 溶液（表 1）替换：通过进液管依靠重力缓慢流入新溶液以置换 DS，同时连接至真空废液容器的出液管排出 chamber 内液体，防止溢出。
注意：E 溶液含有四乙基铵（TEA+）和铯（Cs+）离子，用于抑制 K+ 电流。 - 在二甲基亚砜（DMSO）中配制两性霉素 B 工作母液（每 10 µL DMSO 溶解 1 mg 两性霉素 B）。为完全溶解两性霉素粉末，需进行超声处理（至少 15 分钟）并充分涡旋混合。
注意：此步骤通常耗时少于 10 分钟。将 3–4 mg 两性霉素 B 溶于 30–40 µL DMSO 的 1.5 mL 微离心管中效果良好。较大剂量的两性霉素 B 需要更多 DMSO 溶剂，通常导致混合时间延长且管中残留的两性霉素 B 固体颗粒难以完全溶解。 - 将两性霉素 B 储存液溶于移液管溶液（溶液 P，表 1）中，终浓度为 200–500 µg/mL。此步骤需长时间高强度超声和涡旋（高速设置 8–10/10），每步约 30 至 60 分钟，以确保充分混匀并防止两性霉素 B 在移液管溶液中形成沉淀。
注意：两性霉素 B 会随时间沉淀且对光敏感。含两性霉素 B 的工作移液管溶液需检查其溶解状态，在填充移液管前手动混匀，并避光保存。 - 拉制多个膜片电极，火焰抛光电极尖端，并（如有需要）用电工蜡涂覆电极尖端。
- 将电极短暂浸入不含两性霉素 B 的移液管溶液（溶液 P，表 1）中，使电极尖端充满该溶液。
- 用含两性霉素 B 的相同移液管溶液反向填充电极。
- 将电极安装至连接膜片钳放大器前置放大器的电极夹持器上。
- 使用显微操作器，将电极置于细胞外液表面下方，使电极尖端刚好浸没。
- 在电压钳模式下，将保持电位设为 0 mV，并使用商用放大器上的移液管偏移调节旋钮（材料表）将电流调至 0 pA。
- 使用商用采集软件的“膜测试”窗口/功能（材料表）测定电极电阻。可通过点击 Tools>Membrane Test>Play 或软件中的快捷图标启动该功能。测得的电极电阻应在 2 至 5 MΩ 范围内。
注意：商用采集软件提供的膜测试功能或放大器上的封接测试选项，可通过重复施加电压阶跃来监测电极电阻。 - 使用显微操作器将电极移向选定的 DSM 细胞的同时，持续监测电极电阻（图 1A）。
注意：一个可接受的 DSM 细胞应呈现纺锤形的细长形态，细胞周围有清晰的晕环，边缘分明，并具有半收缩性（蛇形）外观。 - 当电极接触细胞表面时——表现为膜测试功能测得的电极电阻迅速升高——通过连接管路对电极夹持器施加轻柔而快速的负压，形成吉欧封接（giga-seal）。该负压在电极尖端产生，将细胞膜吸入电极，有助于电极与质膜之间形成吉欧封接或极紧密的接触（图 1B）。
- 吉欧封接形成后，通过调节商用放大器上的快速和慢速旋钮补偿移液管电容，并使用膜测试功能监测吉欧封接的稳定性（漏电流）。
- 给予足够时间（通常为 30–60 分钟），使两性霉素 B 沿移液管向下扩散并插入质膜，形成主要对单价阳离子具有选择性的孔道。在此期间，继续使用膜测试功能监测吉欧封接状态。随着细胞穿孔程度增加，电容瞬变的幅度也随之增大（比较 图 1B 与 图 1C，分别显示无穿孔和有效穿孔状态），该变化可通过膜测试功能测得。
- 当膜片穿孔达到最佳状态（表现为串联电阻稳定，通常低于 50 MΩ）时，调节放大器上的细胞电容和串联电阻旋钮，消除电容瞬变。此时也可进行串联电阻补偿（图 1D）。
- 一旦观察到由特定刺激方案诱发的稳定电压阶跃阳离子电流，即可通过灌流施加待测化合物或生理条件，并使用商用采集软件记录对照、测试条件及洗脱（如可行）阶段的反应。
- 采用常规电压阶跃方案记录电流：将 DSM 细胞钳制在 -64 或 -74 mV，以 10 mV 为增量，在 -94 至 +96 或 +106 mV 范围内施加 400 或 500 ms 的电压阶跃，随后返回保持电位。
注意：膜电位值已根据 14 mV 的液接电位进行校正（使用 P 和 E 溶液，表 1）。液接电位可通过商用采集软件（材料表）中的 Tools>Junction Potentials 功能输入溶液离子浓度后获得。也可使用斜坡电压方案获取电流记录。 - 实验过程中以约每分钟连续运行一次电压方案，记录加药前对照、测试条件及洗脱阶段的电流。
- 采用常规电压阶跃方案记录电流：将 DSM 细胞钳制在 -64 或 -74 mV，以 10 mV 为增量，在 -94 至 +96 或 +106 mV 范围内施加 400 或 500 ms 的电压阶跃，随后返回保持电位。
| 溶液类型 | 成分（单位：mM） |
| DS（解剖/消化溶液） | 80 Na-谷氨酸盐，55 NaCl，6 KCl，10 HEPES，2 MgCl2 和 11 葡萄糖，用 10 M NaOH 调节 pH 至 7.4 |
| DS-P（含木瓜蛋白酶的 DS） | 含 1–2 mg/ml 木瓜蛋白酶、1 mg/ml 二硫苏糖醇和 1 mg/ml 牛血清白蛋白的 DS 溶液 |
| DS-C（含胶原酶的 DS） | 含 1–2 mg/ml II 型胶原酶、1 mg/ml 牛血清白蛋白、0 或 1 mg/ml 胰蛋白酶抑制剂以及 100–200 μM Ca2+ 的 DS 溶液 |
| P（移液电极溶液） | 110 CsOH，110 天冬氨酸，10 NaCl，1 MgCl2，10 HEPES，0.05 EGTA 和 30 CsCl，用 CsOH 调节 pH 至 7.2，并添加两性霉素-B（300–500 μg/ml） |
| E（细胞外溶液） | 10 四乙基氯化铵（TEA），6 CsCl，124 NaCl，1 MgCl2，2 CaCl2，10 HEPES 和 10 葡萄糖，用 NaOH 或 CsOH 调节 pH 至 7.3–7.4，并含 0.002–3（2–3 mM）硝苯地平 |
表1：解剖/消化液（DS）以及穿孔膜片钳实验中所用移液管液和细胞外液的成分。
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结果
图1： 人源DSM细胞形成吉欧姆密封及两性霉素B穿孔过程的示意图。图中展示了含两性霉素B的移液管与DSM细胞的空间位置，以及通过在商用采集软件（材料表）中改变电压阶跃（本示例中为-10或-20 mV）所测得的膜测试响应结果，以确定电阻。各配置分别为：(A) 电极接近细胞前的状态，(B) 通过将含两性霉素B的移液管（两性霉素B以红色圆点表示）置于细胞表面并施加负压后形成吉欧姆密封的状态，(C) 吉欧姆密封形成约45分钟后显示的“on-cell”构型，此时两性霉素B已沿移液管向下扩散，其分子插...
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5 ml 聚苯乙烯圆底管 | Falcon | 352054 | 用于盛装消化步骤中所用酶的 DS 管 |
| 两性霉素 B | Fisher | BP928-250 | 用于膜片钳/细胞穿孔 |
| 两性霉素 B | 欧洲药典标准品 | 5 | 用于膜片钳/细胞穿孔 |
| 两性霉素 B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | 用于膜片钳/细胞穿孔 |
| 模拟旋涡混合器 | VWR | 58816-121 | |
| 天冬氨酸 | Sigma-Aldrich | A9006 | 细胞内移液管溶液 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A7906 | DS |
| CaCl₂ | Sigma-Aldrich | C1016 | 细胞外溶液和 DS |
| 毛细玻璃管 | Sutter | BF150-110-7.5 | 用于制备拉制膜片电极的毛细管 |
| 氢氧化铯水合物 | Sigma-Aldrich | C8518 | 细胞内移液管溶液 |
| Clampex 版本 10 软件，包含数据采集（Clampex）和分析（Clampfit）程序 | Axon Instruments/ Molecular Devices | pCLAMP-10 | 商用软件，为膜片钳装置系统的一部分 |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 203025 | 细胞外和细胞内溶液 |
| 牙科蜡 | Miltex Dental Wax Technologies, Inc. | 18058351 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D2650 | 溶剂 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Ca²⁺ 螯合剂，用于细胞内移液管溶液 |
| Flaming/Brown 微电极拉制仪 | Sutter | P-97 | 用于拉制具有极细尖端的电极 |
| 浮式泡沫试管架/支架 | VWR Scientific | 82017-634 | 用于固定盛有酶的试管以实现温度控制 |
| 葡萄糖 | Sigma | G8270 | |
| 谷氨酸钠盐 | Sigma-Aldrich | G1626 | DS |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | pH 缓冲液 |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | 细胞外溶液 |
| 低噪声数据采集系统 | Axon Instruments/ Molecular Devices | Digidata 1440A | 膜片钳装置系统的一部分 |
| 磁力搅拌器 | VWR | 01-442-684 | |
| MgCl₂（六水合物） | Sigma-Aldrich | M2670 | 细胞外和细胞内溶液 |
| MicroForge | Narishige | MF-830 | 用于电极的火焰抛光 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | 细胞外和细胞内溶液 |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 硝苯地平 | Sigma-Aldrich | N7634 | L 型电压门控 Ca²⁺ 通道阻断剂 |
| Nikon 倒置显微镜 TS100，配备 T1-SM 载物台及 5x、10x、20x 和 40x 物镜 | Nikon | 已停产 | 膜片钳装置系统的一部分 |
| 非金属注射器针头，MicroFil | WPI | MF-34G-5 | 用于填充细胞内移液管溶液 |
| 巴斯德吸管 | FisherBrand | 13-678-20A | 吸管尖端被打断并进行火焰抛光，用于滴定经酶处理的组织，以从组织块中分离单个 DSM 细胞 |
| 膜片钳放大器 | Axon Instruments/ Molecular Devices | Axon Axopatch 200B | 膜片钳装置系统的一部分 |
| PC 计算机 | DELL | 定制配置 | 膜片钳装置系统的一部分 |
| pH 计 | Aspera Instruments | PH700 | |
| 聚乙烯管 | Intramedic | 427-436 | 用于连接玻璃底记录室的细胞外灌流管路 |
| 四乙基氯化铵 | Sigma-Aldrich | T2265 | 添加至细胞外浴液中的 Kv 和 BK 通道离子通道阻断剂 |
| 电子天平 | Mettler Toledo | XS64 | |
| Zeiss Axiovert 40C 倒置显微镜，配备 10x 和 40x 物镜 | Carl-Zeiss | 已停产 | 膜片钳装置系统的一部分 |
