两性霉素 B 介导的穿孔膜片钳分析:一种研究膀胱细胞中离子电流的电生理技术

Abstract

来源:Malysz， J. et al.制备和利用新鲜分离的人逼尿肌平滑肌细胞表征 9-菲敏感阳离子电流。J. Vis. Exp.（2020 年）

该视频演示了使用两性霉素 B 介导的穿孔膜片钳技术对逼尿肌平滑肌细胞中瞬时受体电位美拉他汀 4 型 （TRPM4） 离子通道的阳离子电流的表征。该技术有助于评估离子通道的生物物理和药理学特性。

Protocol

1. 使用两性霉素-B 穿孔全细胞电压膜片钳技术记录 DSM 电池的电压阶跃感应阳离子电流

1. 将 0.25–1 mL 细胞悬液移液到倒置显微镜载物台上的玻璃底腔室中，让细胞粘附在玻璃底部。
2. 孵育至少 45 分钟后，从浴中取出消化液 （DS），并通过超级灌注更换为 E 溶液（表 1），其中通过入口管的重力辅助溶液流缓慢地用新溶液替换 DS><，而连接到真空废液容器的出口管去除腔室溶液并防止溢出。 注意:E 溶液含有四乙基铵 （TEA⁺） 和铯 （^Cs+） 离子，可抑制 K⁺ 电流。
3. 在二甲基亚砜 （DMSO） 中制备两性霉素-B 的工作储备溶液（每 10 μL DMSO 1 mg）。要完全溶解两性霉素粉末，超声处理（至少 15 分钟）并充分涡旋溶液><。 注意:此步骤通常需要不到 10 分钟。将 3-4 mg 两性霉素-B 溶于 1.5 mL 微量离心管中的 30-40 μL DSMO 中效果很好。较多的两性霉素-B 需要更多的 DSMO 溶剂，通常会导致混合间隔较长，并且管中存在的两性霉素-B 固体颗粒溶解不完全。
4. 将两性霉素-B 的储备液溶解在移液管溶液（溶液 P，表 1）中，以获得 200–500 μg/mL 的最终浓度。此步骤需要以高速设置 （8–10/10） 进行广泛的超声处理和涡旋，每步 ~30 至 60 分钟，以确保最佳混合并防止移液器溶液中形成两性霉素 B 沉淀><物。 注意:两性霉素-B 会随着时间的推移沉淀并且对光敏感。检查含有两性霉素-B 的工作移液器溶液的溶解度，在移液器填充前手动混合，并避光保存。
5. 拉动多个贴片电极，用火抛光电极尖端，并（如果需要）在尖端涂上牙蜡。
通过将
6. 电极短暂浸入溶液中，用不含两性霉素-B 的移液器溶液（溶液 P，表 1）填充贴片电极的尖端。
7. 用含有两性霉素-B 的相同移液器溶液回填电极。
8. 将电极安装到连接到膜片钳放大器头级的支架上。
9. 使用显微作器，将电极放在细胞外溶液表面的正下方，使电极的尖端刚刚浸没。
10. 在电压钳模式下，使用商用放大器上的移液器偏置拨盘将保持电位设置为 0 mV 并将电流调节至 0 pA（材料表）。
11. 使用商业采集软件（材料表）的膜测试窗口/功能确定电极电阻。要激活，请单击 Tools>Membrane Test>Play 或软件中的快捷方式图标。确定的电极电阻应在 2 至 5 MΩ.
    的范围内 注意:商用采集软件中提供的膜测试功能或放大器上的密封测试选项可用于通过重复施加电压步长来监测电极电阻。
12. 继续监测电极电阻，同时用显微纵器将电极推进到选定的 DSM 电池（图 1A）
    注意:要被视为有活力的 DSM 细胞，该细胞必须表现出纺锤形细长的形态、细胞周围轮廓分明的光晕、清晰的边缘和半收缩（蛇形）外观。
13. 当电极接触电池表面时（通过膜测试功能测得的电极电阻快速增加），通过管道对电极支架施加温和的快速负压，形成千兆密封。这导致在电极尖端产生负压，将细胞膜拉入电极，有助于形成千兆密封或在电极和质膜之间形成非常紧密的接触（图 1B）。
14. 形成 giga-seal 后，通过调整商用放大器上的快速和慢速刻度盘来补偿移液器电容，并使用膜测试功能监测 giga-seal 稳定性（泄漏电流）。
15. 留出时间（通常为 30-60 分钟），让两性霉素-B 沿移液管扩散并插入质膜，形成主要对单价阳离子具有选择性的孔。在此步骤中，使用 Membrane Test 功能继续监测 giga-seal。随着细胞穿孔的增加，使用膜测试功能测量的电容瞬变的幅度也会增加（比较图 1B 和图 1C，分别显示无和有效细胞穿孔）。
16. 当贴片穿孔最佳时（根据稳定的串联电阻通常低于 50 MΩ 来判断），通过调整放大器上的电池电容和串联电阻刻度盘来抵消电容瞬变。此时也可以进行串联电阻补偿（图 1D）。
17. 一旦观察到由指定方案引起的稳定电压阶跃感应阳离子电流，应用化合物或生理条件通过超熔进行测试，并使用商业采集软件记录控制、测试条件和冲洗（如果可能）的响应。
    1. 使用常规电压步进协议记录电流，该协议包括将 DSM 电池保持在 -64 或 -74 mV，并以 10 mV 的增量将电压从 -94 步进到 +96 或 +106 mV，持续 400 或 500 ms，然后返回到保持电位。
       注意:针对 14 mV 的液接电位调整膜电位值（使用 P 和 E 溶液，表 1）。在商业采集软件（材料表）中，通过单击"工具">"液络部电位"并输入溶液离子组分的浓度来获得液接电位。ramp 协议也可用于获取当前记录。
    2. 在实验期间以连续 ~1 分钟的间隔运行电压协议，记录用于添加前控制、测试条件和冲洗的电流

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 解决方案类型 成分（单位:mM） DS （解剖/消化液） 80 Na-谷氨酸、55 NaCl、6 KCl、10 HEPES、2 MgCl₂ 和 11 葡萄糖，pH 调节至 7.4（含 10 M NaOH） DS-P（含木瓜蛋白酶的 DS） DS 含有 1–2 mg/ml 木瓜蛋白酶、1 mg/ml 二硫苏糖醇和 1 mg/ml 牛血清白蛋白 DS-C（含胶原酶的 DS） 含有 1–2 mg/ml II 型胶原酶、1 mg/ml 牛血清白蛋白、0 或 1 mg/ml 胰蛋白酶抑制剂和 100-200 μM Ca²⁺ 的 DS 溶液 P （移液管） 110 CsOH、110 天冬氨酸、10 NaCl、1 MgCl₂、10 HEPES、0.05 EGTA 和 30 CsCl，用 CsOH 将 pH 值调节至 7.2，并补充两性霉素-B （300-500 μg/ml） E （细胞外） 10 个四乙基氯化铵 （TEA）、6 个 CsCl、124 个 NaCl、1 个 MgCl₂、2 个 CaCl₂、10 个 HEPES 和 10 个葡萄糖，用 NaOH 或 CsOH 将 pH 值调节至 7.3-7.4，以及 0.002-3 （2-3 mM） 硝苯地平

表 1:用于穿孔膜片钳实验的解剖/消化溶液 （DS） 以及移液器和细胞外溶液的成分。

Results

图 1:人 DSM 细胞千兆密封形成和两性霉素 B 穿孔所涉及的步骤示意图。图示是含有两性霉素 B 的移液器和 DSM 电池的空间位置，以及通过改变电压步长（在本例中为 -10 或 -20 mV）确定电阻，在商业采集软件（材料表）中获得的膜测试的相关响应。配置是:（A） 在用电极接近细胞之前，（B） 通过将含有两性霉素-B 的移液管（两性霉素-B 由红点表示）定位到细胞表面并施加负压获得千兆密封形成后，（C） 显示细胞上配置在千兆密封形成后 ~45 分钟，此时两性霉素-B 已沿移液器扩散，其分子已插入质膜在电极的尖端形成阳离子渗透孔，以及 （D） 与 （C） 中的配置相同，但使用放大器上的全电池电容和串联...

Materials