肾小球分离：从小鼠肾脏获取完整肾小球的技术

摘要

来源：Eymael, J. 等. 肾小球外生长作为体外分析壁层上皮细胞活化相关通路的方法. J. Vis. Exp. (2020)

本视频介绍了从小鼠肾脏中分离完整肾小球的方法。所获得的带囊和去囊肾小球可进一步用于培养小鼠肾脏的壁层上皮细胞外生长物。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

注意：未接受治疗的健康野生型（WT）小鼠（n = 4）和 cd44-/- 小鼠（n = 4）在12−16周龄时被处死。实验中使用了雄性和雌性小鼠。所有小鼠均以C57Bl/6为遗传背景。

1. 小鼠肾脏解剖

1. 通过颈椎脱位法处死健康的野生型小鼠或基因改造小鼠。
2. 在处死小鼠后立即解剖完整的小鼠肾脏。操作时，使用腹部剪刀进行正中腹切口，依次剪开皮肤和腹肌。取出肠管并置于小鼠体侧。
3. 用手术镊子分离肾脏周围的结缔组织，夹住肾脏并将其拉出，同时用剪刀切断肾动脉、肾静脉和输尿管。
4. 用手术镊子夹住肾脏，再用另一把镊子剥离并去除肾包膜。
5. 将肾脏放入已准备好的6孔细胞培养板中（每孔2个肾脏），每孔加入2 mL Hanks' 平衡盐溶液（HBSS），并置于冰上。

2. 小鼠肾脏肾小球的分离

1. 将肾脏转移至一个100 mm的培养皿中，使用两把手术刀将肾脏切成1−2 mm大小的小块。用1−2 mL HBSS保持肾脏碎块湿润。
2. 将切碎的肾脏组织置于300 µm金属筛网上，使用20 mL注射器的推杆将肾脏组织压过筛网。期间反复用HBSS冲洗筛网，并用移液管将滤过液收集至一个干净的培养皿中。用手术刀刮下残留在筛网底面的所有组织/粘附物，并将其转移至已收集的滤过液中（即肾脏匀浆）。
3. 用HBSS将肾脏匀浆通过75 µm筛网过滤。收集滤过液，再将该滤过液通过53 µm筛网进行过滤。使用HBSS清洗两个筛网，以去除所有较小的结构。
   注意：此步骤中，仅用HBSS冲洗滤过液，但不施加压力使其强行通过75 µm和53 µm筛网。HBSS洗涤的目的是去除筛网上的碎片和较小结构，因此通常总共使用200−300 mL HBSS。
4. 用添加了20%胎牛血清（FCS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）冲洗75 µm和53 µm筛网的上表面，收集残留在筛网上的肾脏结构/材料，并将其转移至6孔超低吸附细胞培养板中。
   注意：为清洗筛网上表面，应将筛网倾斜（>45°）冲洗，并在筛网边缘收集肾脏材料。所收集的材料富含带包膜和去包膜的肾小球，仅含少量肾小管片段。带包膜的肾小球具有很强的粘附性。为获得单个肾小球，关键在于防止其粘附在培养皿或孔板表面。为避免粘附，本步骤中应使用含20% FCS的培养基，并采用超低吸附培养板。

3. 肾小球外植块的培养

1. 将超低吸附微孔板置于倒置光学显微镜下，使用20 µL移液器收集单个包封和/或去包封的肾小球。避免吸取其他结构或碎片。当移液器吸头中已收集到 单个肾小球后，向同一吸头中加入不含已收集肾脏材料的新鲜DMEM培养基，使总体积达到20 µL。
2. 将含有20 µL DMEM培养基的单个肾小球转移至24孔细胞培养板的某一孔中央，于37 °C、5% (v/v) CO₂ 条件下孵育3小时，以使肾小球附着于孔底中央。操作时应小心移动培养板，防止肾小球漂浮至孔的边缘。
3. 孵育3小时后，肾小球已附着于孔中央。小心向每孔中加入500 µL内皮细胞基础培养基（EBM），该培养基需添加含有氢化可的松、人内皮细胞生长因子、牛脑提取物和硫酸庆大霉素-两性霉素B的生长因子试剂盒（材料表），并额外补充5% (v/v) 胎牛血清（FBS）和1% (v/v) 青霉素/链霉素（pen/strep）。
4. 在37 °C、5% (v/v) CO₂条件下培养单个肾小球6天。
   注意：在6天内，将形成由壁层上皮细胞组成的细胞外延生长。若需检测特定化合物或药物对壁层上皮细胞的影响，应在该6天培养期间将其加入培养基中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔细胞培养板	Corning Costar
数字倒置光学显微镜	Westburg, EVOS fl 显微镜
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Lonza
胎牛血清	Lonza
汉克斯平衡盐溶液	Gibco
培养皿	Sarstedt		规格：100
手术刀	Dahlhausen		规格：10
筛网	Endecotts Ltd		规格：300 µm、75 µm、53 µm，不锈钢
超低吸附微孔板	Corning Costar		6孔板
注射器	BD Plastipak		规格：20 mL