建立小鼠正位膀胱肿瘤模型：将癌细胞经膀胱内灌注植入小鼠膀胱的操作步骤 关键词：正位肿瘤模型，膀胱肿瘤，小鼠模型，膀胱内灌注，癌细胞植入

摘要

来源：Tham, S. M. 等。一种小鼠原位膀胱肿瘤模型及肿瘤检测系统 J. Vis. Exp. (2017)

在本视频中，我们介绍了将癌细胞注入小鼠模型膀胱的经膀胱灌注操作。该操作有助于建立正位膀胱肿瘤模型，可用于开发治疗策略。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 植入肿瘤

注意：每只小鼠在膀胱内接种 1 × 10⁵ MB49-PSA 细胞，悬浮于 50 µL 的 DMEM 无菌培养基中。由于导管存在死腔，务必额外准备一定体积的细胞悬液（每只小鼠至少多准备 100 µL）。另一种替代方法是使用充满空气的注射器。

1. 细胞
   1. 植入前一天，当细胞融合度约为80%时，以1:2的传代比例将MB49-PSA肿瘤细胞传代至含完全DMEM培养基（补充10% FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺、0.05 mg/mL青霉素-链霉素和200 µg/mL潮霉素B）中，在37 °C、5% CO₂ 条件下培养。
   2. 在操作当天，用无菌细胞刮刀轻轻刮取细胞收集细胞。取等体积的细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液混合，使用血细胞计数板计数活细胞。若死亡细胞超过20%，则不得用于植入。
   3. 计算所需活细胞数量（2 × 10⁶ 个细胞/mL），并将细胞转移至15 mL离心管中。在4 °C条件下以250 ×g离心5分钟，弃去上清液。用无血清DMEM培养基重悬细胞沉淀。为在植入前彻底去除FBS残留，重复洗涤三次。
   4. 将细胞悬液置于冰上，直至小鼠准备就绪进行植入。
2. 让4至6周龄的雌性C57BL/6J小鼠在操作前适应环境一周。所有动物操作均须在生物安全柜中进行，以维持无菌条件。
   1. 称量每只小鼠体重，并按每10 g体重注射0.1 mL的剂量腹腔注射麻醉剂（75 mg/kg氯胺酮和1 mg/kg美托咪啶）。小鼠体重应在17至22 g之间。通过脚趾夹捏后无反应来确认麻醉成功。
   2. 为便于识别，使用耳标钳在耳朵上打孔标记。
   3. 为维持水合状态，每1–2小时腹腔注射一次 Hartmann's溶液 或复方乳酸钠溶液，剂量为每10 g体重0.1 mL。
   4. 由于麻醉状态下眨眼反射消失，眼睛容易干燥，因此需使用无菌棉签涂抹无菌眼用软膏于双眼。必要时重新涂抹。
   5. 将小鼠仰卧置于加热垫（通过接触空气激活）上方的纸巾上，以维持体温，并用胶带固定后肢。
3. 用手指轻压下腹部区域，将膀胱中的尿液收集至1.5 mL微量离心管中。该样本作为尿液PSA的基础值。
4. 将无菌聚-L-赖氨酸（PLL）吸入1 mL注射器中，连接24号静脉导管（拔除针芯）。在导管尖端涂抹润滑剂，使用镊子引导导管经尿道插入膀胱。当感到阻力时停止插入。
   注意： 研究人员应与兽医人员讨论在膀胱内灌注过程中是否需要使用含麻醉成分的润滑凝胶，以及术后是否需使用镇痛剂。
5. 缓慢灌注50 µL PLL，速度为每20秒10 µL，以避免发生膀胱输尿管反流。导管保留在膀胱内20分钟，并用堵头封闭以防止液体流出。
6. 20分钟后，拔出导管，并通过轻压下腹部排空膀胱内容物。使用一支空的1 mL注射器冲洗导管内残留液体。
7. 通过移液充分混匀MB49-PSA细胞，吸入1 mL注射器中。连接导管并涂抹润滑剂。以每20秒10 µL的缓慢速度灌注50 µL含1 × 10⁵ 个细胞的悬液。在导管上重新安装堵头。对照组小鼠灌注50 µL生理盐水。
8. 1小时后，拔除导管并排空膀胱内容物。解除后肢胶带，将小鼠置于俯卧位。按每10 g体重0.1 mL的剂量皮下注射拮抗剂（1 mg/kg阿替美唑）以复苏小鼠。
9. 持续监测小鼠直至观察到自主运动，然后将其放回笼中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MB49-PSA 细胞			参考文献（Wu QH, 2004）
杜尔贝科改良伊格尔 培养基（DMEM）	Biowest	L0102
南美胎牛血清（FBS）	Biowest	S1810
优质南美胎牛血清（FBS）	Biowest	S181B
胎牛血清（FBS）	HyClone	SH30088.03
L-谷氨酰胺 Biowest X0550	Biowest	X0550
青霉素-链霉素	Biowest	L0022
潮霉素B	Invitrogen	10687-010
C57BL/6J 雌性小鼠	In Vivos		4-6 周龄
麻醉剂（75 mg/kg 氯胺酮和 1 mg/kg 美托咪啶）	本地药房
逆转药物（1 mg/kg 阿替美唑）	本地药房
耳标打孔器	Electron Microscopy Sciences	72893-01
哈特曼溶液或复方乳酸钠	B Braun
眼用软膏 - Duratears 无菌眼用润滑软膏	Alcon
热敷包 - HotHands 暖手袋	Heatmax Inc
Introcan Certo 静脉留置针	B Braun	4251300	24 G x 3/4″
Aquagel 润滑胶	本地药房
聚-L-赖氨酸溶液，0.01%	Sigma	P4707