将DNA质粒递送至小鼠膀胱尿路上皮：一种基于电穿孔的高效递送方法，用于在小鼠膀胱尿路上皮细胞中导入DNA质粒以构建基因工程模型

摘要

来源：Chuan, Y. 等. 通过电穿孔将质粒DNA递送至小鼠膀胱尿路上皮的新方法. J. Vis. Exp.  (2018)

本视频展示了利用尿道插管与电穿孔技术相结合的方法，将DNA质粒递送至小鼠膀胱尿路上皮。所述操作步骤可用于建立小鼠膀胱癌模型。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 质粒与工具准备

1. 每只需转染的膀胱，准备至少 20 µL 的 DNA 质粒（1 µg/µL）。
2. 在 1.5 mL 微量离心管中，向 20 µL 质粒溶液中加入 1 µL 台盼蓝，用移液器充分混匀。
3. 对所有手术器械进行高压灭菌，并用 70% 乙醇消毒操作空间。在执行以下步骤时，应频繁用 70% 乙醇喷洒手术器械和手套，或使用玻璃珠灭菌器 以维持无菌条件。

2. 质粒递送

1. 用70%乙醇处理麻醉小鼠的腹部，并使用手术刀在膀胱上方的腹部皮肤做1 cm的纵向切口。
2. 用移液器将至少20 µL质粒与台盼蓝溶液加入导管的外端，并连接注射器。
3. 将质粒溶液注入膀胱。若膀胱变为蓝色，则表明注射成功。导管中需保留少量液体，以避免在膀胱内产生气泡。
4. 用镊子夹住尿道外口，随后拔出导管和注射器。用细线结扎尿道外口，绕两圈后打两个结。
   注意：结扎尿道对于防止质粒液体反流至关重要。
5. 开启电穿孔仪，设置参数为：33 V，工作时间50 ms，间隔时间950 ms。
6. 用镊子固定膀胱，并用两个电极夹住膀胱，踩下脚踏开关进行电穿孔。
   注意：每次踩下脚踏开关后，电脉冲将以短间隔连续进行5次。在此过程中，小鼠可能出现抽搐。多次踩下脚踏开关可提高转染效率，但过多的电脉冲可能损伤尿路上皮的组织完整性。
   1. 避免镊子与电极之间发生接触，否则将产生电火花。

3. 恢复

1. 使用无菌手术缝线和缝合钉闭合腹腔和皮肤切口，并在伤口处涂抹碘伏。
2. 将动物从异氟烷麻醉系统中移出，皮下注射布托啡诺镇痛剂（0.1 mg/kg）以缓解术后疼痛。
3. 将动物置于加热垫上，待其完全恢复后放回饲养笼。每日至少检查一次，观察其活动能力、饮水和进食行为是否正常，且无感染迹象，直至切口愈合，随后拆除缝合钉。若动物出现理毛行为减少、攻击性增强或发声等疼痛症状，应追加注射布托啡诺镇痛剂。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD 1 mL TB 注射器	Fisher	148232E
布托啡诺	Sigma	B9275-50MG
杜蒙特镊子	Roboz Surgical Instr	RS-5005	手术使用前用 70% 乙醇处理
ECM830 方波电穿孔仪	Harvard Apparatus	450052
Exel International 一次性安全型静脉导管	Fisher Scientific	14-841-21	24G，长度 2.11 cm，外径 0.045 cm
超细显微解剖剪	Roboz Surgical Instr	RS-5135	手术使用前用 70% 乙醇处理
异氟烷	Vet one	501017
K&H 小动物加热静卧垫，9 英寸 × 12 英寸	Amazon		用纸巾覆盖加热垫
眼科软膏	Fisher	NC0849514
PBS，pH 7.4	Life Technologies	10010049
移液器吸头 200 µL	USA Scientific	1111-0206
移液器吸头，通用型；0.1 至 10 µL	Fisher	02707438(CS)
PIPETMAN NEO P2	Gilson	F144561
PIPETMAN NEO P200N	Gilson	F144565
质粒 CAG-GFP	Addgene	16664
铂金镊状电极，5 mm	Harvard Apparatus	450489	直径 5 mm
剪刀	Roboz Surgical Instr	RS-5880	手术使用前用 70% 乙醇处理
绳线	Amazon		Mandala Crafts 150D 210D 0.8 mm 1 mm 皮革缝纫用扁平蜡线绳
Scotch 透明胶带	Fisher	19047257
Therio-gel 兽用润滑剂	PBS animal health	353-736
台盼蓝染色液	Life Technologies	15250061
V-1 台式麻醉系统	VetEquip	901806
薇乔紫线缝合线 18" FS-2 圆刃 5-0	Fisher	NC0578475
Walgreens 聚维酮碘 10%	Walgreens	953982
伤口夹	Fisher	18045
伤口夹施加器	Fisher	1804