外泌体分离:一种基于密度的超速离心技术，使用蔗糖垫将外泌体与培养细胞的条件培养基分离

摘要

来源:Faruqu， F. N. et al. 制备用于 siRNA 递送至癌细胞的外泌体。J. Vis. Exp. （2018 年）

该视频介绍了一种基于密度的超速离心技术，该技术使用在氧化氘中制备的 25% （w/w） 蔗糖垫从人胚胎肾细胞培养物中收获的条件培养基中分离外泌体。分离的外泌体可用于下游应用。

方案

1. 蔗糖垫上的外泌体分离

1. 通过差速离心和过滤预清除收获的调节培养基 （CM），如下所示。
   1. 在 4 °C 下以 500 x g 离心 5 分钟。将上清液转移到新管中并弃去沉淀。再次重复此离心步骤，回收上清液并丢弃沉淀。
   2. 将步骤 1.1 中的上清液离心。在 2,000 x g 下离心 15 分钟和 4 °C，然后弃去沉淀。通过 0.22 μm 过滤器过滤回收的上清液一次。
2. 在预澄清过程中，通过在通用管中准确称取 1.9 g （± 0.001 g） 蔗糖，然后在氧化氘中加注直至重量达到 7.6 g （± 0.001 g），在氧化氘中制备 25% （w/w） 蔗糖溶液。
3. 用 22.5 mL 预先澄清的 CM 填充超速离心管（参见材料表）。如果当前体积小于该值，则用 0.22 μm 过滤的 PBS 将 CM 补足至 22.5 mL。
4. 将玻璃移液管（参见材料表）放入试管中，通过它加入 3 mL 蔗糖溶液，使溶液在 CM 下方形成单独的层。
5. 小心地将含有分层 CM/蔗糖溶液的试管放入水平转子的桶中（参见材料表），并将桶固定到转子中。
6. 将转子放入超速离心机中（参见材料表），并在 4 °C 下以 100,000 x g 旋转 1.5 小时。
7. 收集 2 mL 蔗糖层并将其添加到含有 20 mL 过滤 PBS 的超速离心瓶（参见材料表）中，用于洗涤步骤。
8. 将试管放入固定角转子中（参见材料表），并在 4°C 下以 100,000 x g 旋转 1.5 小时。
9. 用 10 mL 血清移液管小心去除上清液，并用 400 μL 过滤的 PBS 重悬沉淀。将此外泌体原液分别保存在 4 °C 或 -80 °C 进行短期和长期储存。

材料