外泌体分离：利用蔗糖垫密度梯度超速离心法从培养细胞条件培养基中分离外泌体

摘要

来源：Faruqu, F. N. 等。用于向癌细胞递送siRNA的外泌体的制备 J. Vis. Exp. (2018)

本视频介绍了一种基于密度的超速离心技术，用于从人胚胎肾细胞培养物收集的条件培养基中分离外泌体，该方法采用在重水中配制的25%（w/w）蔗糖垫层。所分离的外泌体可用于后续应用。

方案

1. 外泌体在蔗糖垫上的分离

1. 通过差速离心和过滤预清除收集的条件培养基（CM），步骤如下：
   1. 在 4 °C 下以 500 ×g 离心 5 分钟。将上清转移至新管中，弃去沉淀。重复此离心步骤一次，再次收集上清并弃去沉淀。
   2. 将步骤 1.1获得的上清在 4 °C 下以 2,000 × g 离心 15 分钟，然后弃去沉淀。将所得上清通过 0.22 µm 滤器过滤一次。
2. 在预清除过程中，通过精确称取 1.9 g（± 0.001 g）蔗糖至一通用管中，再用重水（deuterium oxide）定容至总重量为 7.6 g（± 0.001 g），配制 25%（w/w）的蔗糖溶液。
3. 用 22.5 mL 预清除的 CM 填充一支超速离心管（见 材料表）。若体积不足，用 0.22 µm 过滤的 PBS 补足至 22.5 mL。
4. 将一根玻璃移液管（见 材料表）放入管中，通过该管缓慢加入 3 mL 蔗糖溶液，使溶液在 CM 下方形成独立的一层。
5. 小心将含有分层 CM/蔗糖溶液的离心管放入摆出式转子的吊桶中（见 材料表），并将吊桶牢固安装至转子中。
6. 将转子放入超速离心机中（见 材料表），在 4 °C 下以 100,000 ×g 离心 1.5 小时。
7. 收集 2 mL 蔗糖层，并将其加入含有 20 mL 过滤 PBS 的超速离心瓶中（见 材料表），用于洗涤步骤。
8. 将离心管放入固定角转子中（见 材料表），在 4 °C 下以 100,000 × g 离心 1.5 小时。
9. 用 10 mL 移液管小心吸除上清，将沉淀用 400 µL 过滤 PBS 重悬。外泌体储备液可分别于 4 °C 或 -80 °C 保存，用于短期或长期储存。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蔗糖	Fisher Scientific	S/8600/60	1 kg
重水（D2O）	Sigma-Aldrich	151882	250 g
1× 磷酸盐缓冲液（PBS）	Thermo Fisher Scientific	10010015	500 ml
Millex-GP 针筒式滤器，0.22 µm	Millipore	SLGP033RS
超速离心机	Beckman Coulter	Optima XPN-80
水平转子	Beckman Coulter	SW45 Ti
固定角转子	Beckman Coulter	Type 70 Ti
超速离心管	Beckman Coulter	355631	聚碳酸酯材质，最大装液量 32 ml
超速离心瓶	Beckman Coulter	355618	聚碳酸酯材质，最小装液量 16 ml，最大装液量 25 ml
离心机	Eppendorf	5810R
玻璃移液管	Fisher Scientific	1156-6963
25% w/w 蔗糖垫层			在通用管中加入 1.9 g（± 0.001 g）蔗糖，再用 D2O 补足至总重量为 7.6 g（± 0.001 g）。可配制约 6 ml 的 25% w/w 蔗糖垫层。