小鼠肾细胞分离:一种分离和产生肾小管上皮细胞原代培养物的技术

摘要

来源:Ding， W. et al. 小鼠原代肾小管上皮细胞的分离、表征和高通量细胞外通量分析。 J. Vis. Exp.（2018 年）

在本视频中，我们演示了分离和纯化肾小管上皮细胞的步骤，用于广泛的分子生物学和细胞培养研究。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 组织处理和原代肾小管细胞分离

1. 取出肾包膜和髓质，将两个肾脏切成小块，然后在 37 °C 烘箱中用 10 mL 消化缓冲液孵育 5 分钟。
2. 通过将缓冲液通过 70 μm 过滤器去除任何未消化的肾组织。加入 10 mL 培养基以停止消化。
3. 要收集肾小管细胞，将过滤后的细胞悬液以 50 x g 离心 5 分钟以收集第一个沉淀。将上清液转移到新试管中，加入 5 mL 培养基，以 50 x g 离心 5 分钟，以确保所有肾小管细胞都收集到第二个沉淀中。离心速度较低，主要沉淀重小管。随后，在细胞从分离中恢复后，纯管状培养物在传代培养过程中以更高的速度离心。
将
4. 第一个沉淀重悬于 20 mL 培养基中，并以 50 x g 离心 5 分钟以收集第三个沉淀。
将
5. 第二个和第三个沉淀重悬于 1 mL 培养基中。将 10 μL 细胞悬液与 10 μL 台盼蓝混合，将混合物加载到计数玻片的腔室 A 中，并从自动细胞计数器记录细胞活力。
6. 将多达 10 个⁷ 个细胞（异质群体）接种到预先涂有胶原蛋白的单个 60 mm 培养皿上，让肾小管细胞附着过夜。

材料