过碘酸雪夫染色或PAS染色：一种评估肾小球结构畸形的方法

摘要

来源：Stevens, M., Oltean, S. 肾小球疾病小鼠模型中肾功能的评估 J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中，我们介绍了进行过碘酸雪夫（PAS）染色以评估肾小球结构异常的实验方案。PAS染色法可有效用于肾小球病理生理学的适当评估。

方案

1. 过碘酸雪夫（PAS）染色

注意：PAS 染色将显示肾小球毛细血管袢和肾小管上皮的基底膜。该染色可详细显示肾小球细胞、系膜基质及其可能的扩张，以及肾小球基底膜（GBM）的潜在变化（如增厚和不规则）。

1. 使用切片机将石蜡包埋的PFA固定肾皮质切成5 µm厚度，展于多聚赖氨酸包被的载玻片上，37 °C干燥1小时。确保切片无皱褶或孔洞，以免在显微镜下观察时形态失真。
2. 脱蜡：将载玻片先后浸入二甲苯（注意，具刺激性；应在通风橱中操作）中两次，每次3分钟；再依次浸入100%乙醇两次，每次3分钟；随后分别浸入95%、70%和50%乙醇中，每次3分钟，均在室温下进行。最后将载玻片在去离子水（dH₂O）中充分水化。
3. 将载玻片浸入高碘酸溶液（注意，具刺激性；应在通风橱中操作）（1 g/dL）中，室温孵育5分钟，然后在多次更换的去离子水（dH₂O）中漂洗。使用盛有100 mL去离子水（dH₂O）的容器，室温操作。
4. 将载玻片置于希夫试剂（对品红盐酸盐6 g/L，亚硫酸氢钠4%溶于0.25 mol/L盐酸）中，室温孵育15分钟。随后用流动自来水冲洗载玻片5分钟。
5. 用苏木精复染3秒，然后用流动自来水彻底冲洗载玻片15分钟。
   注意：苏木精染色时间可能需要根据实际情况进行优化，以确定最佳染色时长。
6. 按照与脱蜡相反的步骤进行脱水。最后以二甲苯结束脱水过程。
7. 将载玻片自然晾干，使用以二甲苯为基质的封片剂封片。
8. 在光学显微镜下以400X 放大倍数观察，评估肾小球结构。需评估以下指标：肾小球基底膜（GBM）增厚及不规则性、毛细血管袢塌陷、纤维化组织、硬化、细胞增殖（内皮细胞、足细胞、系膜细胞或浸润至肾小球簇的炎性细胞）。
   注意：为全面评估肾小球病理生理变化，还应检查肾脏其他部位的病变，例如肾小管中的病变。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
过碘酸-雪夫（PAS）染色试剂盒	Sigma-Aldrich	395B-1KT
苏木精	Sigma-Aldrich	H3136
二甲苯	MerckMillipore	108298
防脱载玻片	Sigma-Aldrich	P0425-72EA
封片介质	ThermoFisher Scientific	8030
疏水笔	Abcam	ab2601
荧光显微镜	Leica Microsystems
Image J 图像分析软件	Image J